Evolución de la resistencia adquirida en CPNM ROS1⁺ KRAS G12C⁺ a través de la vía MAPK

El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte relacionada con neoplasias en hombres y mujeres en los Estados Unidos [1]. En pacientes con diagnóstico reciente de cáncer de pulmón no-microcítico (CPNM) metastásico, las decisiones de tratamiento se basan en la elaboración de un perfil molecular amplio del tumor, que incluye la secuenciación tisular y la detección de fusiones y amplificaciones oncogénicas [2]. En un subconjunto de estos pacientes, las pruebas moleculares podrán identificar alteraciones atacables, como una mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor receptor, EGFR) o una fusión del protooncogén ROS1 (ROS proto-oncogene 1, ROS1). Los pacientes con CPNM portadores de una alteración abordable, como una fusión de ROS1, pueden experimentar un control duradero y prolongado de la enfermedad con inhibidores de la tirosina quinasa molecularmente dirigidos.

Para 1–2% de los pacientes diagnosticados con CPNM positivo para una fusión de ROS1 (ROS1⁺), una opción terapéutica actual de primera línea, el entrectinib, produce una respuesta clínica en la mayoría de los pacientes, con una supervivencia esperada que se mide en años [3]. A pesar de la eficacia de la terapia con inhibidores de la tirosina quinasa (tyrosine kinase inhibitors, TKI), casi todos los casos de CPNM ROS1⁺ desarrollan resistencia al tratamiento, y en algún momento se observa progresión de la enfermedad. Al producirse la progresión, es frecuente realizar pruebas moleculares repetidas de tejido o de DNA libre de células, porque algunos mecanismos de resistencia a los TKI pueden inhibirse con otras terapias clínicamente disponibles [4]. La resistencia adquirida a los TKI ROS1 puede ser mediada por mecanismos dependientes de ROS1, como las mutaciones del dominio quinasa de ROS1, o por mecanismos que no dependen de ROS1, entre ellos una señalización alterna a través de la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase, MAPK). Se han descrito mutaciones o amplificaciones adquiridas en el oncogén homólogo al virus Kirsten de sarcoma de rata (Kristen rat Sarcoma, KRAS) en un subconjunto de pacientes con CPNM ROS1⁺ [5]. Las resistencias derivadas de mutaciones en KRAS, específicamente mutaciones KRAS p.G12C, son de especial interés dado el desarrollo y la disponibilidad clínica de inhibidores de KRAS G12C [6]. Estas alteraciones concurrentes en otros impulsores susceptibles de tratamiento se observan principalmente al presentarse la resistencia a los TKI, y raramente en el diagnóstico.⁷ Presentamos el caso de un paciente con adenocarcinoma metastásico de pulmón que presentaba tanto una fusión de ROS1 como una mutación KRAS p.G12C, detectadas en el momento del diagnóstico. A pesar de las terapias molecularmente dirigidas para ambas alteraciones oncogénicas, el paciente no experimentó beneficio clínico con el tratamiento, probablemente debido a la evolución de un clon portador de KRAS p.G12C y la eventual amplificación del gen. Este caso subraya la importancia de establecer perfiles moleculares amplios en el CPNM avanzado, tanto en el momento del diagnóstico como en hitos del tratamiento, entre ellos la progresión, para personalizar la terapia y las perspectivas de los pacientes.

Un hombre de 57 años con historial de tabaquismo de menos de 5 paquetes-año se presentó con dolor bilateral en las piernas debido a una trombosis venosa profunda en ambos miembros inferiores. Una tomografía computarizada (TC) torácica mostró múltiples émbolos pulmonares agudos y subagudos bilaterales, y una masa ganglionar hiliar izquierda con linfadenopatía mediastínica izquierda. Una broncoscopia con biopsias endobronquiales guiadas por ultrasonido mostró un adenocarcinoma consistente con un tumor pulmonar primario en la estación 11L (Fig. 1a). Mientras se mantenía la anticoagulación tras el procedimiento, el paciente presentó afasia expresiva y se detectó un infarto agudo en la arteria cerebral media. Durante su recuperación, las pruebas moleculares de la biopsia revelaron una fusión de ROS1, identificada por hibridación fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), y la secuenciación de próxima generación (next-generation sequencing, NGS) del DNA tumoral identificó una mutación KRAS p.G12C y una mutación del promotor de la transcriptasa inversa de la telomerasa (telomerase reverse transcriptase, TERT) (c.-124C>T). En el momento del diagnóstico se determinó una frecuencia alélica variante (variant allele frequency, VAF) de 3.2% para KRAS p.G12C y de 12.9% para la mutación en TERT. La tomografía por emisión de positrones (positron emission tomography, PET) mostró una masa hiliar izquierda ávida de FDG y adenopatías extensas en todo el cuello y el mediastino (Fig. 1b). La resonancia magnética (magnetic resonance imaging, MRI) del cerebro no mostró indicios de metástasis intracraneales. Se administró al paciente entrectinib como tratamiento de primera línea.

Aproximadamente tres meses después, el paciente desarrolló un derrame pleural del lado izquierdo, y una toracocentesis dio un resultado positivo para adenocarcinoma pulmonar metastásico. Las pruebas moleculares demostraron de nuevo la presencia de una fusión de ROS1, detectada por FISH, y una mutación KRAS p.G12C. La frecuencia alélica de KRAS p.G12C fue 62%, en comparación con 40% para la mutación en TERT, lo que sugiere el crecimiento de clones portadores de la mutación KRAS p.G12C. La posterior secuenciación tisular mediante NGS en nuestra institución no detectó mutaciones en el dominio quinasa de ROS1, y se determinó que el evento de fusión era TPM3(ex8)-ROS1(ex35). Las imágenes PET revelaron una resolución casi completa de la masa hiliar izquierda previamente ávida de FDG y de la adenopatía de cuello y mediastino, pero se observó un nuevo nódulo posterior ávido de FDG en el lóbulo inferior izquierdo y un engrosamiento pleural izquierdo (Fig. 1b). En una institución externa comenzó a tratarse al paciente con pembrolizumab, además de continuar con entrectinib.

Un mes después, el paciente se presentó en nuestra institución con afasia expresiva progresiva. La MRI cerebral mostró nuevas lesiones multifocales supratentoriales, predominantemente en los lóbulos frontal y parietal izquierdos (Fig. 1b). El paciente recibió radioterapia para las lesiones cerebrales. Aproximadamente cuatro semanas después, el paciente comenzó a recibir sotorasib más entrectinib y se suspendió el pembrolizumab. Un día después del inicio de la terapia dirigida dual, el paciente requirió hospitalización por hipoxia progresiva debida a embolias pulmonares bilaterales y una nueva neumonía adquirida en la comunidad, que no se consideraron debidas a la inmunoterapia previa ni a la terapia dirigida dual. Durante el tratamiento con ambas terapias dirigidas, el paciente se sometió a evaluaciones frecuentes por parte de su oncólogo de cabecera y su equipo clínico. El paciente no experimentó eventos adversos que pudieran relacionarse con la terapia combinada. En concreto, no precisó terapia antiemética y mantuvo un peso estable durante sus evaluaciones. No se observaron anomalías en las pruebas de función hepática ni en los electrolitos, y la creatinina fue normal. Aproximadamente dos meses después, el paciente regresó con empeoramiento progresivo en la afasia basal, luego de una semana de debilidad y parestesias en el brazo derecho. La MRI cerebral mostró progresión a intervalos en tres lesiones hemorrágicas dentro del hemisferio cerebral izquierdo (Fig. 1b). La TC del tórax, el abdomen y la pelvis mostró progresión en la enfermedad pleural izquierda, con nueva linfadenopatía abdominal. Durante la hospitalización se realizó biopsia de una masa pleural izquierda, y las pruebas moleculares mostraron una VAF de 98% para KRAS p.G12C, frente a 23% para la mutación en TERT. Durante la hospitalización, el paciente experimentó recuperación clínica del habla y de la función del brazo derecho. Se reinició la anticoagulación con argatrobán debido a un descenso de 40% en el recuento de plaquetas en cinco días, con exposición reciente a heparina de bajo peso molecular. El día de inicio del argatrobán, el paciente experimentó un deterioro clínico agudo mientras deambulaba, se observaron pupilas fijas y dilatadas, y falleció probablemente debido a una hemorragia intracraneal aguda.

Antes del inicio del sotorasib, se recogió líquido pleural para la generación de líneas celulares (Fig. 1a). La línea celular que se desarrolló se designó CUTO64 (TPM3-ROS1), y mostró resistencia al entrectinib y el crizotinib, dos terapias de primera línea dirigidas contra ROS1, con concentración inhibitoria media (IC₅₀) > 2000 nM para ambos agentes, en contraste con una línea celular sensible a ROS1 TKI derivada de un paciente distinto, CUTO37 (CD74-ROS1), que presentó una IC₅₀ de 56 nM con crizotinib y de 39 nM con entrectinib (Fig. 2a). CUTO64 fue igualmente resistente al ceritinib además del lorlatinib, tratamiento de segunda línea, con IC₅₀ > 2000 nM para ambos. (Fig. 2a). CUTO28 (TPM3-ROS1), línea celular derivada de un paciente distinto, mostró sensibilidad al entrectinib, con IC₅₀ de 8.3 nM (Fig. 2 suplementaria, disponible en www.nature.com/articles/s41698-023-00349-0), lo que sugiere que la resistencia a los TKI ROS1 en CUTO64 no se debe al componente de fusión en ROS1.

Puesto que las pruebas clínicas del paciente también mostraron una mutación KRAS p.G12C, utilizamos la combinación de entrectinib más los inhibidores de KRAS G12C sotorasib o adagrasib, los cuales redujeron la viabilidad celular en comparación con cualquiera de los agentes por separado (Fig. 2b). El entrectinib más el sotorasib mostraron una IC₅₀ de 5.8 nM, mientras que el entrectinib más el adagrasib presentaron una IC₅₀ de 7.8 nM, en contraste con las IC₅₀ de un solo agente, > 1900 nM, > 2600 nM y > 1000 nM para el entrectinib, el sotorasib y el adagrasib, respectivamente. El tratamiento de CUTO64 con entrectinib y un inhibidor de KRAS G12C fue sinérgico, con índices de combinación (IC) de 0.12 y 0.17 para la coadministración con sotorasib o adagrasib, respectivamente. Se observó un patrón similar con crizotinib más sotorasib o adagrasib (Fig. 2c), con una IC₅₀ > 1000 nM para cada fármaco por separado. La combinación de crizotinib y un inhibidor de KRAS G12C fue sinérgica, con un IC de 0.16 para crizotinib más sotorasib, y de 0.21 para crizotinib más adagrasib. La inhibición de la vía de señalización MAPK con trametinib, un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos 1 y 2 (MEK1/2), redujo la viabilidad de CUTO64 cuando se combinó con entrectinib o crizotinib (Fig. 2d).

Dado que la inhibición concurrente de ROS1 y KRAS G12C aumentó la sensibilidad celular a la terapia dirigida, evaluamos las vías de señalización corriente abajo de cada impulsor. El tratamiento de CUTO64 con entrectinib produjo inhibición de pROS1, lo que sugiere que la resistencia no se debía a una mutación del dominio quinasa observada en aproximadamente 40% de los pacientes durante la progresión bajo tratamiento con TKI de agente único [5]. La inhibición de ROS1 condujo a una reducción dependiente de la dosis en la actividad de la proteína quinasa B (Akt) corriente abajo, pero tuvo un impacto limitado en la señalización de la quinasa regulada por señales extracelulares (extracellular-signal-regulated kinase, ERK) a concentraciones más altas del fármaco (Fig. 2e). El sotorasib como agente único redujo la señalización de ERK, pero no tuvo impacto sobre pROS1 o pAkt (Fig. 2f). La combinación de entrectinib más sotorasib produjo una potente inhibición de las vías MAPK y Akt (Fig. 2f).

Estudios previos han señalado la amplificación de KRAS como mecanismo adquirido de resistencia en pacientes con progresión en terapias dirigidas a ROS1, en modelos preclínicos con KRAS p.G12C positivo que evalúan el sotorasib y en pacientes que reciben otros inhibidores de KRAS G12C [5, 8‒10]. Las pruebas clínicas realizadas en muestras de biopsia del paciente demostraron un aumento de la frecuencia de alelos de la variante KRAS p.G12C en comparación con una mutación pasajera en TERT a lo largo del tiempo, lo que sugiere una selección evolutiva de la co-mutación y amplificación de KRAS p.G12C como mecanismo adquirido de resistencia durante el curso terapéutico del paciente (Fig. 1a). Las pruebas ampliadas con la estrategia basada en la NGS de 498 genes en investigación no detectaron la amplificación de KRAS p.G12C durante el diagnóstico a través de nuestra estructura bioinformática, que incluye una evaluación de las alteraciones en el número de copias (Fig. 3a). Tras iniciarse la terapia, la amplificación de KRAS p.G12C no se detectó durante la progresión bajo tratamiento con entrectinib, pero fue fácilmente detectable durante la progresión de la enfermedad bajo entrectinib y sotorasib. Verificamos además esta amplificación con la muestra de tejido durante la progresión bajo entrectinib y sotorasib mediante FISH, que reveló una relación KRAS/CEP12 de 11.5 y una positividad ROS1 uniforme en todas las células tumorales (Fig. 3b).

Este reporte de caso resalta la importancia crítica de elaborar perfiles moleculares amplios en pacientes con cáncer de pulmón metastásico, porque las alteraciones concurrentes pueden aportar información en las discusiones pronósticas y opciones terapéuticas adicionales [11]. Hasta donde sabemos, este caso es también el primer reporte de un adenocarcinoma pulmonar que presenta tanto una fusión de ROS1 como una mutación KRAS p.G12C detectadas durante el diagnóstico, y del uso concurrente de terapias dirigidas para ambos impulsores. La resistencia mediada por KRAS a los inhibidores de ROS1 se predijo en modelos preclínicos con crizotinib, en los que se identificó una mutación KRAS p.G12C en la línea celular HCC78 ROS1⁺ (SLC34A2-ROS1) [12]. Este caso clínico es también consistente con trabajos previos de nuestro grupo que mostraron resistencia primaria a la terapia con TKI en un paciente con fusión concurrente del gen ALK y mutación KRAS p.G12C [13, 14]. La señalización alterna a través de la vía MAPK es un conocido impulsor de la resistencia a la terapia con TKI ROS1, y hay ensayos clínicos en curso que exploran la utilidad de combinar los TKI ROS1 con la inhibición de MEK [12, 15‒17]. Sin embargo, como ilustra este caso, las terapias de precisión dirigidas a alteraciones impulsoras pueden verse superadas rápidamente por la resistencia adaptativa. El tratamiento clínico de la progresión sistémica con un TKI dirigido a la fusión de ROS1 puede basarse en pruebas moleculares posteriores, realizadas durante la progresión [18]. Para este paciente, las opciones de tratamiento incluyeron una estrategia combinada para los impulsores oncogénicos conocidos, o quimioterapia, con o sin la continuación de la terapia dirigida. Aunque la inhibición de KRAS G12C representa un nuevo enfoque terapéutico para los pacientes con cáncer de pulmón, los datos prospectivos reportan tasas de respuesta de 40.7% en el escenario de la línea subsecuente, y una duración de la respuesta de aproximadamente un año 8 [19]. Series retrospectivas en pacientes con CPNM positivo para la fusión de ROS1 y bajo quimioterapia basada en pemetrexed reportan un rango en la respuesta de la enfermedad de 23.8% a 54.5% [20, 21]. Históricamente, la continuación de la terapia con TKI mientras se recibía quimioterapia en la línea subsecuente no mejoró los resultados, pero ésta sigue siendo un área activa de investigación, especialmente en la era de los TKI con penetración en el SNC [22‒24].

Cabe destacar que, incluso en presencia de una mutación KRAS p.G12C, la terapia inicial con entrectinib produjo mejoría clínica en la carga tumoral mediastínica del paciente, que persistió hasta su fallecimiento. Los estudios con células CUTO64 derivadas durante la progresión bajo el entrectinib, sugieren que el tumor seguía siendo parcialmente dependiente de ROS1, porque la reducción máxima de la viabilidad celular se logró cuando la inhibición de ROS1 se acompañó con la inhibición de la vía MAPK. Del mismo modo, los inhibidores de KRAS G12C de agente único tuvieron un impacto limitado en la viabilidad de CUTO64 en ausencia de inhibición de ROS1. La doble dependencia de CUTO64 con respecto a ROS1 y KRAS G12C se reflejó además en las distintas vías de señalización corriente abajo activadas por cada impulsor. Sin embargo, no se observó beneficio clínico con la terapia combinada de entrectinib y sotorasib, probablemente debido a la amplificación de KRAS observada en las pruebas moleculares. Clínicamente, el paciente no tuvo acceso a los inhibidores de KRAS G12C hasta que la enfermedad se hallaba más avanzada, cuando la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA) aprobó el uso de sotorasib en la línea subsecuente. Con base en la dependencia parcial de CUTO64 de ambos impulsores, podría haberse observado beneficio clínico si se hubiera iniciado la combinación de entrectinib y sotorasib en el momento del diagnóstico. Debido a la respuesta inicial a la terapia y a consideraciones clínicas, las biopsias tumorales no se obtuvieron del mismo sitio, y la heterogeneidad espacial de las muestras obtenidas es una limitación de nuestro estudio [25]. El análisis molecular de las muestras en los momentos de progresión puede reflejar factores vinculados con el tejido que configuran el paisaje genómico de las células cancerosas, además de los mecanismos intrínsecos de resistencia terapéutica de dichas células [25].

La presencia simultánea de impulsores susceptibles de tratamiento en el CPNM es infrecuente, pero la aplicación de las pruebas NGS a la atención clínica ha mejorado el reconocimiento de este hecho. En una serie retrospectiva de 3077 pacientes diagnosticados con CPNM, las pruebas de NGS identificaron impulsores oncogénicos concurrentes potencialmente atacables en 46 pacientes, incluidos 16 pacientes identificados antes del inicio de la terapia [26]. Se ha reportado que los pacientes con CPNM portadores de múltiples alteraciones direccionables experimentan un control sostenido de la enfermedad, ya sea mediante terapias dirigidas a oncogenes alternantes o mediante enfoques combinados [26‒28]. Los casos reportados incluyen con frecuencia mutaciones en EGFR junto con fusiones de ALK o amplificaciones de MET. Un número menor de estudios han descrito un CPNM ROS1 positivo con oncogenes controladores concomitantes, y ha habido cierta discrepancia en la frecuencia reportada de impulsores concurrentes, probablemente debido al método de detección de la fusión de ROS1 [7, 29, 30]. Los ensayos de NGS en 166 casos de CPNM ROS1⁺ sin información clínica asociada identificaron a un paciente con CPNM ROS1⁺ con una mutación concurrente EGFR L858R, y a tres pacientes con CPNM ROS1⁺ y una mutación activadora en KRAS (Q61R, G12R, G12C) [7]. En casos de progresión bajo tratamiento con un TKI ROS1 se han reportado también cambios adquiridos vinculados con la activación alterna de la vía de señalización MAPK, incluyendo mutaciones y amplificaciones activadoras de KRAS [5]. Algunos estudios preclínicos asociaron la resistencia al entrectinib con la adquisición de una mutación KRAS p.G12C y la amplificación tanto de KRAS como de FGFR3 en HCC78, una línea celular de CPNM portadora de una fusión de ROS1 [8]. En este modelo, la resistencia al entrectinib se asoció con una activación sostenida de pERK, y la resensibilización a la inhibición de ROS1 se logró con la adición de selumetinib, un inhibidor de MEK1/2. La amplificación de KRAS también se ha descrito como mecanismo de resistencia al sotorasib en un paciente con CPNM mutante en KRAS p.G12C, y en un paciente con cáncer de colon mutante en KRAS p.G12C [10]. Una posible estrategia para superar la amplificación de KRAS es actuar sobre los componentes corriente arriba o abajo en la vía de señalización KRAS, tal como se está explorando en los primeros ensayos clínicos con inhibidores de SHP2 e inhibidores de ERK1/2 [31].

Nuestros datos, junto con otros estudios, subrayan la importancia de valorar las alteraciones de la vía MAPK como parte de una evaluación amplia cuando se detecta resistencia a los TKI ROS1. Además de identificar un probable mecanismo de resistencia, el panorama terapéutico para abordar las alteraciones de la vía MAPK sigue ampliándose, para incluir los inhibidores de KRAS G12C disponibles clínicamente y los ensayos clínicos en curso que prueban la inhibición de mutaciones KRAS distintas de G12C, así como objetivos corriente abajo como MEK y ERK [32, 33]. En conclusión, este caso clínico subraya la necesidad de realizar pruebas moleculares exhaustivas en pacientes con cáncer de pulmón metastásico en el momento del diagnóstico, así como cuando se presenta progresión aun con terapia dirigida, porque los múltiples impulsores oncogénicos atacables pueden influir en la elección del tratamiento y en las expectativas de control de la enfermedad.

Las pruebas clínicas iniciales se realizaron mediante el perfil pulmonar de análisis NeoTYPE^TM (Neogenomics), que analiza 49 biomarcadores mediante una combinación de secuenciación de próxima generación (NGS), hibridación fluorescente in situ e inmunohistoquímica [34].

El análisis mutacional de las muestras clínicas también se realizó mediante un enfoque basado en la NGS de 498 genes, en la Universidad de Colorado (Laboratorio de Correlatos Moleculares de Colorado). Brevemente, se extrajo el ácido nucleico total y se disgregó mecánicamente. A continuación, el ácido nucleico disgregado se empleó para preparar bibliotecas utilizando el kit KAPA Hyper Prep (Roche, Basilea, Suiza). El enriquecimiento en objetivos de la biblioteca se realizó utilizando sondas y kit de hibridación xGen Lockdown (IDT, Coralville, IA). A continuación, la biblioteca enriquecida se secuenció en un instrumento Illumina NextSeq (Illumina, San Diego CA). Los datos de las secuencias en bruto se analizaron en busca de mutaciones e inserciones/deleciones con una línea de producción bioinformática personalizada que utilizó Novosort para la alineación de lecturas, GATK/Mutect2 y VarScan2 para la llamada de variantes, y Ensenbl Variant Effect Predictor para la anotación de variantes. Las alteraciones en el número de copias se determinaron utilizando CNVkit [35].

Los ensayos FISH de color dual se realizaron en secciones de 4 µm de muestras tumorales fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) con sondas ROS1 break-apart (Vysis, Abbott molecular y Agilent) y KRAS/12 centromere enumeration (Empire Genomics), mediante digestión enzimática con proteinasa K, o en células cultivadas derivadas de pacientes. Las señales de las sondas fluorescentes se evaluaron en un mínimo de 50 núcleos tumorales por muestra. Los especímenes se contaron como positivos para el rearreglo ROS1 si 15% o más de las células mostraban un patrón de señal dividida 5’/3’ y/o única 3’. Se requirió una separación entre las señales ROS1 5’ y 3’ de uno o más diámetros de señal para que se considerara un split. La amplificación de KRAS se definió como una relación entre la sonda KRAS y la sonda de enumeración de 12 centrómeros > 2.0.

Las líneas celulares CUTO64 y CUTO37 se derivaron como se describió previamente con el consentimiento de los pacientes según el protocolo 11-1621 aprobado por el COMIRB, con consentimiento por escrito [36]. Brevemente, la línea CUTO64 se derivó de una muestra del derrame pleural del paciente que se aplicó sobre el medio de gradiente de densidad Ficoll (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich # 10771-100 ML) y se sometió a centrifugación según las recomendaciones del fabricante. El sedimento celular resultante se resuspendió en medio RPMI 1640 (Gibco nº 11875093) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Atlas Biologicals nº F-0500-A) y se sembró en un matraz de 25 cm. De acuerdo con la inspección visual de la morfología celular, cuando las células tumorales adherentes se convirtieron en el tipo celular predominantemente establecido en el matraz de cultivo, el cultivo se sometió a tripsinización diferencial y disociación mecánica para desalojar la población minoritaria restante de células estromales. Las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS y se incubaron a 37°C bajo 5% de CO₂.

Las células CUTO64 y CUTO37 se sembraron con una densidad de 1500 a 2000 células por pozo en una placa de 96 pozos y se trataron con el fármaco designado 24 h después del sembrado. Tras 72 h de exposición al fármaco, se cambió el medio para eliminar los restos celulares y se añadió el reactivo de MTS, según las recomendaciones del fabricante (Promega, G7570). La absorbancia se midió en un lector de microplacas (BioTek) a 490 nm. Las curvas de regresión no-lineal y el IC₅₀ se calcularon con GraphPad Prism v9.3.1 (GraphPad Software) y CompuSyn v1.0 (www.combosyn.com). El índice de combinación se calculó mediante el método de Chou-Talay con CompuSyn v1.0 [37]. El adagrasib, el sotorasib, el trametinib, el ceritinib, el crizotinib, el entrectinib y el lorlatinib se adquirieron en ChemieTek.

Las células se sembraron en una placa de 6 pozos, se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 80–100% y, a continuación, se trataron con los fármacos y las dosis indicadas durante 3 h, y se procesaron en paralelo. Posteriormente, las células se lisaron con 150 μL de reactivo de extracción de proteínas tisulares T-PER (ThermoFisher) con inhibidor de proteasas Halt 1× (ThermoFisher) durante 20 min a 4°C. Se recolectó la solución de lisado y se centrifugó. Se recogió el sobrenadante y se almacenó a -80°C. A continuación, el lisado se diluyó 3:1 con buffer de carga de proteínas 4× (LI-COR) con 0.1 mM de DTT (Thermo-Fisher). Las muestras se cargaron en un gel APS al 10% con Chameleon Duo Ladder (LI-COR) y Page Ruler Prestained Plus Protein Ladder (ThermoFisher) y se hicieron correr. Los geles se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (LI-COR) utilizando Thermofisher PierceG² Fast Blotter, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las membranas se bloquearon en TBS 1× (Research Products International) e Intercept Blocking Buffer (LI-COR) 1:1, y después se marcaron con el anticuerpo indicado. A continuación, las membranas se enjuagaron y se marcaron con anticuerpo de cabra anti-ratón IRDye 800 CW (LI-COR P/N: 926-32210) y anticuerpo de cabra anti-ratón IRDye 680 LT 690 (LI-COR N/P: 926-68021). Todos los anticuerpos secundarios se diluyeron 1:10.000. Las membranas se visualizaron utilizando un equipo LI-COR Odyssey. El procesamiento de los datos de Western blot se realizó con el software LI-COR Image Studio y con GraphPad Prism.

Los anticuerpos utilizados fueron ROS1 (69D6) Mouse mAb (3266S), pROS1 (Y2274) Rabbit Ab (3078S), ERK1/2 p44/p42 MAPK (L34F12) Mouse mAb (4696S), p-ERK1/2 T202/Y204 (197G2) Rabbit mAb (4337S), Akt (pan) (40D4) Mouse mAb (2920S), p-Akt S473 (D9E) Rabbit mAb (4060S) de Cell Signaling Technologies, y Mouse mAb GAPDH (65C) de Millipore (CB1001). Los anticuerpos pROS1 y ROS1 se diluyeron a 1:1000, y todos los demás anticuerpos de Cell Signaling Technology se diluyeron a 1:2000. GAPDH se diluyó a 1:105.

En la Figura Suplementaria 1 (disponible en www.nature.com/articles/s41698-023-00349-0 ) se muestran los escaneados sin recortar ni procesar de los Western blots manuscritos. Todos los blots proceden del mismo experimento y se procesaron en paralelo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del reporte de investigación de Nature vinculado con este artículo en www.nature.com/articles/s41698-023-00349-0.

Todos los datos y recursos generados para este estudio están disponibles en el artículo o, previa solicitud, con el autor corresponsal. Los datos se han depositado con enlaces al número de acceso BioProject PRJNA909827 en la base de datos BioProject del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/). Los metadatos de BioSample están disponibles en la base de datos BioSample del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/) con números de acceso SAMN32100022, SAMN32100023 y SAMN32100024.

El código de la estructura bioinformática está disponible, previa solicitud.

E.L.S. cuenta con el apoyo de la subvención K12 CA086913 del NIH y el LUNGevity Career Development Award #25B1267. Este estudio fue financiado en parte por NIH P30CA06934 Pathology Shared Resource – Cytogenetic Section RRID:SCR_021991 y Molecular Pathology Section RRID:SCR_021995. Agradecemos al Laboratorio de Genética de Colorado, Universidad de Colorado, Campus Médico Anschutz, Aurora, Colorado, su ayuda en el análisis de las muestras clínicas. Queremos agradecer al grupo de defensa de los pacientes ROS1ders (ros1cancer.com) por su apoyo a la investigación sobre ROS1 y su donación de muestras de tejido para la creación de nuevas líneas celulares ROS1, y al Instituto Médico Addario de Cáncer de Pulmón por los fondos destinados a la investigación.

K.P. contribuyó en el diseño, la adquisición e interpretación de los datos, y la redacción y revisión del manuscrito; A.L., A.G., G.B.R., y M.M. contribuyeron en la adquisición de los datos; H.N. contribuyó en el diseño, la adquisición e interpretación de los datos y la revisión del manuscrito; K.D.D. contribuyó en el diseño, la adquisición e interpretación de los datos y la revisión del manuscrito; C.L. contribuyó en el diseño y la adquisición e interpretación de los datos; E.D. contribuyó en el diseño y la adquisición e interpretación de los datos; R.C.D. contribuyó en la adquisición e interpretación de los datos y la revisión del manuscrito; L.B. contribuyó en la adquisición e interpretación de los datos y la revisión del manuscrito; D.L.A. contribuyó en el diseño, la adquisición e interpretación de los datos y la redacción y revisión del manuscrito; E.L.S. contribuyó en la concepción general del estudio, el diseño, la adquisición e interpretación de los datos y la redacción y revisión del manuscrito.

K.D.D. recibió patrocinio para viajes de ArcherDX. R.C.D.; tiene royalties o licencias a través de Rain Therapeutics, Foundation Medicine, Takeda, Pearl River, Scorpion Therapeutics, ThermoFisher, Genentech, Black Diamond, Voronoi; recibió honorarios por consultoría de Rain Therapeutics, Anchiano, Blueprint Medicines, Takeda, AstraZeneca, Genentech/Roche, Bayer, AstraZeneca, Green Peptide; recibió pagos u honorarios por conferencias, presentaciones, agencias de conferenciantes, redacción de manuscritos o eventos educativos: Medscape, Princess Margaret Hospital, Targeted Oncology, OncLive; recibió apoyo para asistir a reuniones o viajar: Genentech/Roche, Blueprint Medicines, Rain Therapeutics; tiene patentes previstas, emitidas o pendientes: Rain Therapeutics, Abbott Molecular; tiene un papel de liderazgo o fiduciario con Rain Therapeutics; forma parte del consejo asesor de Rain Therapeutics. D.L.A. declara haber recibido honorarios por consultoría de Takeda, Sonif-Genzyme, Loxo Oncology, Bluepring Medicines y Genentech. E.L.S. declara haber recibido honorarios como ponente de OncLive, Physicians’ Education Resource, Takeda, Roche/Genetech, IDEO Oncology, Sanofi/Regeneron; honorarios como consultor de Actinium, Bionest Partners, ExpertConnect, FCB Health, Guidepoint Network, the KOL Connection Ltd, Prescient Advisory, y ha formado parte de un consejo asesor de Regeneron, Janssen y G1 therapeutics. Ningún otro autor tiene intereses en conflicto que revelar.

Información suplementaria. La versión original en línea contiene material suplementario, disponible en https://doi.org/10.1038/s41698-023-00349-0.

Katherine Priest, Anh Le, Amanuail Gebregzabheir, Hala Nijmeh, Gregory B. Reis, Melanie Mandell, Kurtis D. Davies, Carolyn Lawrence, Emily O’Donnell, Robert C. Doebele, Liming Bao, Dara L. Aisner, Erin L. Schenk: Evolution of acquired resistance in a ROS1+ KRAS G12C+ NSCLC through the MAPK pathway. NPJ Precis Oncol. 2023 Jan 23;7(1):9 (DOI: 10.1038/s41698-023-00349-0). © 2023 The Author(s) (traducción; nota del editorial acortada), protegido por CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.es).