Die modernste Therapie zur Behandlung von Hornhautendothel­erkrankungen ist die Transplantation. Fortschritte in der Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit chirurgischer Techniken erhöhen die Zahl der Hornhauttransplantationen, was zu einem weltweiten Mangel an Spenderhornhäuten führt und 12,7 Millionen Patienten mit behandelbarer Sehbehinderung zurücklässt. Ansätze zur Regeneration des Hornhautendothels bieten eine Lösung für den derzeitigen Gewebemangel und eine Behandlung für Bedürftige. Methoden zur Herstellung einer ausreichenden Zahl von Hornhautendothelzellen, um den derzeitigen Mangel zu beheben, und mögliche Strategien zu ihrer Bereitstellung sind zu einer therapeutischen Realität geworden. Klinische Studien werden in Japan, Singapur und Mexiko durchgeführt. Bis zur Zulassung solcher Therapien durch die Zulassungsbehörden und zur Einführung in die klinische Praxis ist es jedoch noch ein weiter Weg. Darüber hinaus könnten azelluläre Hornhautendotheltransplantate und bestimmte Arzneimittel eine Behandlungsoption für bestimmte Krankheiten darstellen, ohne dass Spendergewebe oder -zellen benötigt werden. Mit dem Aufkommen von Genmodulationstherapien zur Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen wird es schließlich möglich sein, präsymptomatische Patienten oder Patienten mit frühen Symptomen zu behandeln, was den Bedarf an Spendergewebe drastisch reduzieren würde. Die Kenntnis der neuesten Entwicklungen auf diesem sich rasch entwickelnden Gebiet ist wichtig, um zu verstehen, welche Erkrankungen mit welchen Ansätzen behandelt werden können. Dieser Artikel gibt einen Überblick über aktuelle und in der Entwicklung befindliche Therapien der regenerativen Medizin zur Behandlung von Hornhautendothel­erkrankungen und vermittelt die notwendige Orientierung und das Verständnis für die Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen.

Die Hornhaut ist das durchsichtige Fenster, durch das Licht ins Auge dringt. Dieses avaskuläre Gewebe hat bei Erwachsenen einen Durchmesser von 10–12 mm, eine Dicke von 500–600 μm und einen Brechungsindex von 1,38 [172]. Die äußere Oberfläche der Hornhaut besteht aus einer geschichteten Lage von Hornhaut­epithelzellen. Die Bowman-Membran, eine azelluläre Schicht auf Kollagenbasis, die von den Keratozyten des Stromas synthetisiert wird, trennt das Epithel vom Stroma. Das Stroma der Hornhaut macht 80–90% der Hornhautdicke aus und verleiht dem Gewebe den größten Teil seiner mechanischen Festigkeit. Es besteht hauptsächlich aus hochstrukturierten Kollagenfasern und extrazellulären Matrixproteinen und wird von einer verstreuten Population von Keratozyten besiedelt, die die stromale Homöostase aufrechterhalten. Der innere Teil der Hornhaut ist mit einer Monoschicht dicht gepackter hexagonaler Hornhautendothelzellen (corneal endothelial cells, CECs) ausgekleidet, die mit dem Stroma der Descemet-Membran in Kontakt stehen. Die adulte Descemet-Membran ist eine 3–10 μm dicke [86] Basalmembran, die hauptsächlich aus Kollagen Typ IV und VIII [93] besteht und von den CECs gebildet wird.

Es wird vermutet, dass CECs aus embryonalen Neuralleistenzellen im periokularen Mesenchym entstehen. Nach der Embryonalentwicklung sind humane CECs in der G1-Phase arretiert, d.h. sie können sich nicht teilen und haben nicht die Fähigkeit, diese Schicht durch Zellteilung zu regenerieren. Es wird jedoch immer wieder diskutiert, ob eine periphere Population von CECs ein gewisses proliferatives Potenzial behält [8, 69, 240, 243]. Funktionell wirken CECs als aktive metabolische Pumpe, die Ionen (Na+, K+ und Cl-), Bicarbonat, Glucose und Milchsäure transportiert, was zu einem Nettofluss gelöster Stoffe vom basolateralen/stromalen zum apikalen/wässrigen Humor führt und als Barriere wirkt, die das Eindringen von Wasser aus der vorderen Augenkammer in das Hornhautstroma verhindert [22]. Auf diese Weise wird der leicht dehydrierte Zustand der Hornhaut aufrechterhalten, ein Prozess, der als Entwässerung bezeichnet wird und für die Transparenz der Hornhaut von entscheidender Bedeutung ist.

Die durchschnittliche CEC-Dichte bei gesunden Erwachsenen im Alter von 20–39 Jahren beträgt 3000 Zellen/mm2. Diese Dichte nimmt jährlich um 0,3% ab und erreicht im Endothel gesunder Erwachsener im Alter von 60 bis 79 Jahren durchschnittlich 2600 Zellen/mm2 [258]. Iatrogene Schäden nach Operationen, Infektionen oder genetische Erkrankungen wie die Fuchs’sche Endotheldystrophie (FECD) können zu Funktionsstörungen und einem beschleunigten Verlust der CECs führen. Hornhautendothelerkrankungen sind durch einen Verlust der Barrierefunktion gekennzeichnet, der zu einem Hornhautödem und einer Trübung führt, die das Sehvermögen beeinträchtigen. Hornhauttrübungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Blindheit, und schätzungsweise 12,7 Millionen Menschen warten weltweit auf eine Behandlung [60].

Die Hornhauttransplantation ist die modernste Therapie bei Hornhautendothelerkrankungen. Seit der ersten Transplantation durch Eduard Zirm im Jahr 1905 ist die Hornhaut das weltweit am häufigsten transplantierte Gewebe. Im Jahr 2012 wurden 184 576 Hornhauttransplantationen in 116 Ländern durchgeführt [60].

Die penetrierende Keratoplastik stellt das Sehvermögen effektiv wieder her, aber die 10-Jahres-Überlebensraten der Transplantate schwanken zwischen 36% und 90% [130, 220]. Die größten Einschränkungen dieser Technik sind die hohe Abstoßungsrate von Allotransplantaten und die Komplikationen, die mit der Verwendung von Nähten verbunden sind: Astigmatismus, Infektionen und Wunddehiszenz [184].

Die Endothelkeratoplastik ermöglicht den selektiven Ersatz des erkrankten Hornhautendothels durch das eines Spenders. Die automatisierte Descemet-Stripping-Endothel-Keratoplastik (Descemet Stripping Automated Endothelial Keratoplasty, DSAEK) ist nach wie vor die am häufigsten angewandte Technik [44], aber die Descemet-Membran-Endothel-Keratoplastik (Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty, DMEK) ist auf dem Vormarsch [46]. Die DMEK wurde erstmals 2006 beschrieben und ermöglicht den selektiven Ersatz des dysfunktionellen Endothels und der Descemet-Membran des Empfängers [133]. Die DMEK bietet eine ausgezeichnete und schnelle Wiederherstellung des Sehvermögens [45] mit einem geringen Risiko der Transplantatabstoßung [20, 76]. Sie ist jedoch technisch anspruchsvoll, und in etwa einem Viertel der Fälle kommt es als Komplikation zu einer Ablösung des Transplantats, die einen chirurgischen Eingriff erfordert [46].

Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf vorgefertigte DMEK-Transplantate (Abbildung abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987), die direkt von der Hornhautbank in den Operationssaal transportiert werden können. Dadurch wird das Verfahren auch für unerfahrenere Chirurgen weltweit zugänglich, die Operationszeit verkürzt [46, 27, 146, 169, 192, 224] und die Kosteneffizienz verbessert [21]. Bezüglich der Überbrückung des Gewebemangels wurde über eine Verwendung von Halb- [121] und sogar Viertel-DMEK-Transplantaten [261] berichtet. Aufgrund der geringen CEC-Dichten, die nach diesen Verfahren berichtet wurden, der im Vergleich zur konventionellen DMEK erhöhten Transplantatablösung, der Fälle von persistierendem peripheren Hornhautödem und Bullae sowie der engen Indikationsstellung (d.h. FECD) bleiben diese Techniken jedoch umstritten und haben nicht an Popularität gewonnen. Andere Strategien zur Überwindung des Gewebemangels sind die Verwendung einer Spenderhornhaut zur Behandlung von 2 Patienten mit unterschiedlichen Hornhauterkrankungen, eine Technik, die auch als Split-Cornea-Ansatz bekannt ist. Der Split-Cornea-Ansatz optimiert die Nutzung des Spendergewebes und ermöglicht die Durchführung einer DMEK und einer tiefen anterioren lamellären Keratoplastik mit Transplantaten aus derselben Hornhaut [59, 72].

Die chirurgische Entfernung von 4–5 mm der Descemet-Mem­bran ohne nachfolgende Endotheltransplantation wurde in ausgewählten Fällen bei relativ jungen Patienten mit FECD mit zentralen Guttae und relativ gesundem peripheren Endothel beschrieben [14, 23, 200]. Diese Technik, die als «Descemet’s stripping only» (DSO) oder «descemetorhexis without endothelial keratoplasty» (DWEK) bezeichnet wird, befindet sich noch in einem frühen Entwicklungsstadium (Abb 1). Die derzeitigen Einschränkungen sind die Unvorhersehbarkeit der Ergebnisse und die lange Genesungszeit, in der die Hornhaut geschwollen bleibt. Um den Erfolg dieser Technik zu verbessern, könnten eine pharmakologische Modulation mit Inhibitoren der Rho-assoziierten Proteinkinase (ROCK) oder die Verwendung azellulärer Hornhautendotheltransplantate zur Förderung der Hornhautendothelregeneration erforderlich sein, wie im Abschnitt «Azelluläre Hornhautendotheltransplantate» und im Abschnitt «Pharmakologische Modulation des Hornhautendothels» näher erläutert wird.

Abb. 1.

Schematische Darstellung von «Descemet’s stripping only» (DSO). Um einen besseren Rotreflex zu erzielen, wird zunächst die Pupille pharmakologisch erweitert. Dann wird mit einem Messschieber der zentrale Durchmesser der Hornhaut von 4–5 mm markiert. Mit einem Spalthaken wird anschließend ein kleines Descemet-Membran-Tag am Rand der 4–5-mm-Markierung angebracht. Danach wird das Tag mit einer Pinzette gefasst und die Descemet-Membran abgezogen.

Abb. 1.

Schematische Darstellung von «Descemet’s stripping only» (DSO). Um einen besseren Rotreflex zu erzielen, wird zunächst die Pupille pharmakologisch erweitert. Dann wird mit einem Messschieber der zentrale Durchmesser der Hornhaut von 4–5 mm markiert. Mit einem Spalthaken wird anschließend ein kleines Descemet-Membran-Tag am Rand der 4–5-mm-Markierung angebracht. Danach wird das Tag mit einer Pinzette gefasst und die Descemet-Membran abgezogen.

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Fortschritte in der Hornhauttransplantation verbessern ihre Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit, was zu einer weltweit steigenden Zahl von Transplantationen führt und die Schwelle für Eingriffe in früheren Krankheitsstadien senkt. Leider verschärft die Zunahme der Transplantationen den weltweiten Mangel an Spendergewebe. Es wird geschätzt, dass auf 70 bedürftige Patienten nur eine Spenderhornhaut kommt und weltweit 12,7 Millionen Menschen eine Hornhauttransplantation benötigen [60]. Darüber hinaus hat die COVID-19-Pandemie zu einer Verschärfung der Anforderungen an Transplantatgewebe geführt, was sich auf die weltweite Versorgung mit Hornhautgewebe auswirkt [221]. Während eine Verbesserung sowohl der Logistik von Spenderhornhäuten als auch der Einstellung zur Spende in verschiedenen Gesellschaften den derzeitigen Mangel teilweise beheben könnte, sind wir der Überzeugung, dass eine der attraktivsten Möglichkeiten, das derzeitige Problem des Gewebemangels anzugehen und eine Behandlung für Bedürftige verfügbar zu machen, in der Entwicklung neuer und der Verbesserung bestehender Ansätze zur Regeneration des Hornhautendothels besteht (Abb 2).

Abb. 2.

Es gibt mehrere Ansätze zur Regeneration des Hornhautendothels, die bereits untersucht wurden oder sich in der Entwicklung befinden. Dazu gehören die Hornhauttransplantation, Zelltherapien, azelluläre Ersatztransplantate und die pharmakologische und genetische Modulation des Hornhautendothels.

Abb. 2.

Es gibt mehrere Ansätze zur Regeneration des Hornhautendothels, die bereits untersucht wurden oder sich in der Entwicklung befinden. Dazu gehören die Hornhauttransplantation, Zelltherapien, azelluläre Ersatztransplantate und die pharmakologische und genetische Modulation des Hornhautendothels.

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Die In-vitro-Expansion oder die De-novo-Generierung von CECs aus pluripotenten Stammzellen oder anderen zellulären Quellen ist notwendig, um den derzeitigen Gewebemangel zu beheben und die Therapie für mehr Patienten verfügbar zu machen. Dabei sind jedoch noch einige Herausforderungen zu bewältigen. Das Haupthindernis für die In-vitro-Kultivierung von CECs ist die Schwierigkeit, ruhende Zellen zur Proliferation zu zwingen und gleichzeitig eine endothelial-mesenchymale Transition (EndMT) zu vermeiden, die zu einer zellulären Transdifferenzierung in Richtung eines myofibroblastischen Phänotyps und damit zu einem Funktionsverlust der Zellen führen würde. Aber auch die strengen Auswahlparameter für das Spendergewebe, das für die primäre Expansion geeignet ist, stellen eine Herausforderung dar. Die Alternative der Differenzierung von CECs aus pluripotenten Stammzellen oder anderen zellulären Quellen erfordert die Entwicklung von Protokollen und strengen Endpunkt-Parametern, um sicherzustellen, dass die schließlich als Quelle dienenden Zellen den CECs ähnlich sind.

Primärkultur von Endothelzellen der Hornhaut

Versuche, humane CECs zu kultivieren, reichen bis in die frühen 1980er Jahre zurück. Damals unterschieden sich die publizierten Protokolle erheblich in der Methode zur Isolierung des Hornhaut­endothels und in der Zusammensetzung der Kulturmedien für die In-vitro-Expansion. Die Auswahl der Kulturmedien konzentrierte sich auf die Steigerung der In-vitro-Proliferationsfähigkeit von CECs durch verschiedene Präparationen von Basalmedien (Ham’s F12, Medium 199, Dulbecco’s Modified Eagle Medium oder OPTI-MEM-I), Wachstumsfaktoren (Nervenwachstumsfaktor, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder epidermaler Wachstumsfaktor) und Zusatzstoffen (Hypophysenextrakt, Calciumchlorid, Ascorbinsäure, Insulin, Natriumselenit u.a.). Die Isolierungstechniken reichten von der Präparation von Hornhaut­endothelstücken und Kultivierung der Zellen auf Explantaten [16, 225, 253] über die Herstellung einer Einzelzellsuspension durch Abschaben der Endotheloberfläche mit einem gebogenen Skalpell [50, 225] bis hin zur Behandlung des Hornhautendothels in situ mit einem Enzymcocktail auf Kollagenasebasis zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen [47‒49]. Die Isolierung von Explantaten war zeitaufwändig und aufgrund der manuellen Variabilität der Technik schwer zu reproduzieren. Diese Nachteile erschwerten den Einsatz im therapeutischen Umfeld. Außerdem waren die bisherigen Isolierungsmethoden anfällig für eine Kontamination mit stromalen Fibroblasten, was unerwünscht ist, da die Fibroblastenpopulation die CEC-Population aufgrund ihrer schnelleren Proliferationsrate überwuchern würde. Darüber hi­naus erschwerte die große Variabilität zwischen den Spendern in Bezug auf Todesursache, Alter, Medikamenteneinnahme oder ethnische Zugehörigkeit die ersten Schritte zur Validierung und Erstellung von Protokollen für die Kultivierung primärer CECs.

Im Jahr 2004 ebneten die Arbeiten von Amano und Kollegen den Weg für den Einsatz von Primärkulturen humaner CECs in der regenerativen Medizin. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass primär kultivierte CECs, die aus Hornhautexplantaten isoliert wurden, in der Lage sind, das Hornhautendothel ex vivo in menschlichen Hornhäuten zu rekonstruieren [7] und Hornhautödeme bei Kaninchen und Ratten rückgängig zu machen [135, 138, 139].

Nach der Einführung des Descemet-Stripping in den frühen 2000er Jahren entwickelten sich die Protokolle für Primärkulturen in Richtung des Peel-and-Digest-Ansatzes. Bei dieser Methode wurde das Hornhautendothel zunächst mechanisch von der Hornhaut abgelöst und anschließend durch einen enzymatischen Verdau auf Kollagenasebasis zu einer Zellsuspension verdaut. Dieser Ansatz erhöhte die Reproduzierbarkeit und verringerte gleichzeitig das Risiko einer Kontamination mit anderen Hornhautzelltypen [32, 89, 177, 178, 259], was eine notwendige Verbesserung der Protokolle zur Gewinnung von Zellen für den klinischen Gebrauch darstellt.

Werden CECs gezwungen, ihre G1-Ruhephase zu verlassen und in einen proliferativen Zustand überzugehen, kann dies unbeabsichtigt eine unerwünschte EndMT auslösen, die zum Verlust der Zellfunktion führt [194]. Die EndMT ist durch eine Reihe von zellulären Ereignissen charakterisiert, wie den Verlust von Zell-Zell-Verbindungsproteinen, den Verlust der Zellpolarität, die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts, eine erhöhte Zellmobilität, die abnorme Produktion extrazellulärer Matrix und Veränderungen der Genexpression [194]. Die EndMT ist daher eine der größten Bedrohungen für die primäre Endothelkultur, da sie ein Zellprodukt im besten Fall unbrauchbar und im schlimmsten Fall gefährlich machen kann. Bisher wurde eine Vielzahl von Medien und Supplementen für die Kultivierung von CECs verwendet, wobei das Hauptaugenmerk auf der Förderung der Proliferation unter Beibehaltung des Phänotyps und der Vermeidung des Übergangs in einen mesenchymalen Zustand lag. Durch die Kombination von verschiedenen Basalmedien, fötalem Rinderserum und entweder dem epithelialen Wachstumsfaktor [89, 177, 178, 259] oder dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor [48, 135, 138, 178] konnte die In-vitro-Proliferation wirksam stimuliert und gleichzeitig der Phänotyp der Zellen erhalten werden.

Vergleichende Untersuchungen der Arbeitsgruppen um Mehta [178] und Engelmann [84] haben gezeigt, wie sich unterschiedliche Medienzusammensetzungen auf die primär kultivierten CECs auswirken. Im Jahr 2015 entwickelten Peh et al. [176] ein einzigartiges Protokoll mit einem dualen Medienansatz, um Hornhautendothelzellen zu expandieren und anschließend ihren Phänotyp in vitro zu bewahren. Der duale Medienansatz ermöglicht zunächst die Expansion der Zellen und anschließend die Aufrechterhaltung eines konfluenten Monolayers von Hornhaut­endothelzellen für 1 Woche unter Verwendung eines Mediums, das nur eine geringe Proliferation unterstützt, und ist seither auf diesem Gebiet weit verbreitet [15, 57, 164, 166] (Abb 3).

Abb. 3.

Kultur von humanen Hornhautendothelzellen aus Spendergewebe. (A) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme mit typischer hexagonaler Zellmorphologie. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigt die Anwesenheit von (B) ZO-1 (Zonula Occludens-1), (C) Na+/K+-ATPase, (D) CD166 und (E) Prdx6, die von primären Hornhautendothelzellen exprimiert werden. Die Skala beträgt (A) 100 μm und (B–E) 50 μm. Diese Abbildung wurde freundlicherweise von Dr. Mohit Parekh zur Verfügung gestellt.

Abb. 3.

Kultur von humanen Hornhautendothelzellen aus Spendergewebe. (A) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme mit typischer hexagonaler Zellmorphologie. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigt die Anwesenheit von (B) ZO-1 (Zonula Occludens-1), (C) Na+/K+-ATPase, (D) CD166 und (E) Prdx6, die von primären Hornhautendothelzellen exprimiert werden. Die Skala beträgt (A) 100 μm und (B–E) 50 μm. Diese Abbildung wurde freundlicherweise von Dr. Mohit Parekh zur Verfügung gestellt.

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Verschiedene Supplemente und Zusatzstoffe wie Hypophysenextrakt, Transferrin, Ascorbinsäure, Calciumchlorid oder Natriumselenit wurden ebenfalls untersucht. Einer der erfolgreichsten Ansätze zur Steigerung der Zellproliferation und des Überlebens ist die Zugabe des ROCK-Inhibitors Y-27632, eines niedermolekularen Blockers apoptotischer Signalwege [101, 174, 176, 183]. Andere Ansätze waren die Verwendung von Humanserum [234], konditionierte Medien, die die Variabilität des Protokolls aufgrund der Inkonsistenz von Humanserum erhöhen [55, 145], und ein serumfreier Ansatz [84], um mögliche Alternativen zur Verwendung von fötalem Rinderserum zu untersuchen. Die Zugabe von L-Ascorbat-2-phosphat [203], einem Antioxidans zur Reduktion von oxidativem Stress, oder von Inhibitoren des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) zur Verhinderung von EndMT [151] wurde ebenfalls für die primäre Expansion von CECs untersucht.

Verbesserungen bei der Entwicklung von Protokollen für die CEC-Expansion in vitro führten zu einer ersten klinischen Studie am Menschen. Im Jahr 2018 berichteten Kinoshita et al. [101] über die Verwendung von CEC-Primärkulturen zur erfolgreichen Wiederherstellung des Sehvermögens bei Patienten mit bullöser Keratopathie und FECD. Mit dieser bahnbrechenden klinischen Studie ist es gelungen, Grundlagenforschung in die Klinik zu übertragen und das therapeutische Potenzial von primär kultivierten CECs zu demonstrieren.

Trotz der aktuellen Fortschritte in der Primärkultivierung von CECs bleiben viele Fragen offen. Während die Dichte der Zellaussaat [179] und das junge Spenderalter [37, 141] direkt mit dem Proliferationspotenzial und der Aufrechterhaltung des CEC-Phänotyps korrelieren, bedeutet dies nicht notwendigerweise eine erfolgreiche Primärkultur. Spenderbezogene Faktoren, wie z.B. die Einnahme von Medikamenten [68] oder oxidativer Stress durch hohe zelluläre Stoffwechselaktivität oder starke Exposition gegenüber ultraviolettem Licht [90, 88], könnten die Proliferation und die Aufrechterhaltung des Phänotyps beeinflussen. Eine Sortierung der Spender nach bestimmten Merkmalen wie Todesursache, Alter, Vorerkrankungen, Medikamenteneinnahme und anderen relevanten Faktoren könnte entscheidend sein, um den unterschiedlichen Erfolg der In-vitro-Expansion zu erklären, wenngleich dies weitere Forschung und eine beträchtliche Anzahl von Forschungshornhäuten erfordert. Dennoch könnte die Entwicklung einer umfassenden und spezifischen Spenderanalyse dazu beitragen vorherzusagen, ob eine bestimmte Spenderhornhaut zu einer erfolgreichen CEC-Expansion in vitro führen und letztlich die Menge an Abfallgewebe reduzieren würde.

Ein weiterer komplizierender Faktor ist die Art der Konservierung des Spendergewebes. Die meisten bisherigen Untersuchungen wurden an Hornhäuten durchgeführt, die bis zu 14 Tage gekühlt gelagert wurden. In Europa ist jedoch warmes Organkulturmedium im Allgemeinen die bevorzugte Konservierungsmethode. In den meisten europäischen Ländern ist es nicht möglich, die an gekühlten Hornhäuten gewonnenen Daten direkt auf in Organkulturen konservierte Hornhäute zu übertragen. Bisher gibt es nur wenige Berichte über die Verwendung von Spenderhornhäuten, die in Organkulturmedien konserviert wurden [163, 165, 167]. Die ungelöste Frage ist, wie sich unterschiedliche Lagerungsbedingungen auf die Expansion primärer menschlicher CECs auswirken.

Ein weiteres Problem, das es zu überwinden gilt, ist die Tatsache, dass die Zellen aus ihrer natürlichen Ruhephase gezwungen werden könnten, was sie grundlegend verändern und zu genetischen und phänotypischen Veränderungen führen könnte (Abb 4). Die In-vitro-Expansion kann möglicherweise zu Veränderungen der genomischen Signatur führen, die sich auf den Phänotyp auswirken und funktionelle Konsequenzen haben. Primäre CECs können nur 2-mal passagiert werden, bevor sie genetische und funktionelle Veränderungen aufweisen, was die Anzahl der Zellen begrenzt, die aus einer einzigen Spenderhornhaut gewonnen werden können [35, 56, 57]. Außerdem ist es möglich, dass bei der In-vitro-Expansion von CECs unterschiedliche Zellpopulationen entstehen. Die Identifizierung der Subpopulationen, die den nativen CECs am ähnlichsten sind, auf der Grundlage spezifischer Marker ist für ihre therapeutische Anwendung von größter Bedeutung. Solche spezifischen Marker sind jedoch noch nicht identifiziert worden, was ein weiteres dringendes Forschungsgebiet darstellt.

Abb. 4.

Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahmen von humanen CECs in (A) einer Hornhautendothelbiopsie, (B) primär kultivierten humanen CECs und (C) primär kultivierten CECs, die während der primären Expansion eine charakteristische morphologische Veränderung zeigen, die mit einem Funktionsverlust der Zellen und einem möglichen Übergang von Endothel zu Mesenchym einhergeht. Die Skala beträgt 100 μm.

Abb. 4.

Phasenkontrastlichtmikroskopische Aufnahmen von humanen CECs in (A) einer Hornhautendothelbiopsie, (B) primär kultivierten humanen CECs und (C) primär kultivierten CECs, die während der primären Expansion eine charakteristische morphologische Veränderung zeigen, die mit einem Funktionsverlust der Zellen und einem möglichen Übergang von Endothel zu Mesenchym einhergeht. Die Skala beträgt 100 μm.

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Schließlich wurden für die primäre Expansion von CECs hauptsächlich Hornhäute mit hoher Zelldichte (mehr als 2500 Zellen/mm2) und jungem Alter (weniger als 40 Jahre) verwendet. Dies schränkt die Anzahl geeigneter Hornhäute erheblich ein, was angesichts des Mangels an Spendern eine Herausforderung darstellt. Die Verwendung älterer Hornhäute [163, 165, 167] oder von ausrangierten peripheren Endothelrändern von Hornhäuten, die für chirurgische Eingriffe verwendet wurden, bei denen eine stärkere Proliferation der Zellen erwartet wird [167, 168, 243], würde die Verfügbarkeit von primär kultivierten Zellen für die Therapie erhöhen. Mehta und Kollegen isolierten kürzlich primäre Zellen aus Hornhäuten, die aufgrund von Bindegewebserkrankungen, Diabetes mellitus oder geringer CEC-Dichte nicht für eine Transplantation geeignet waren, um die bullöse Keratopathie der Hornhaut im Kaninchenmodell direkt zu behandeln. Dieser Ansatz hat das Potenzial, den Pool der für die Therapie verfügbaren Zellen zu vergrößern, da bei diesem Verfahren nichtkultivierte Zellen verwendet werden und die Hornhäute entweder für die lamelläre Chirurgie verwendet oder aus dem Spenderpool entfernt werden [159]. Die Verwendung alternativer Zellquellen für die CEC-Primärkultur und die regenerative Medizin könnte die Verfügbarkeit von Zellen für den therapeutischen Einsatz drastisch erhöhen. Es müssen jedoch Lösungen für die geringe Proliferation und den schnellen Verlust des Phänotyps gefunden werden, die bei den derzeitigen Protokollen beobachtet werden.

Pluripotente Stammzellen

Eine neue Quelle für CECs zur Anwendung in der regenerativen Medizin könnte aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden (Abb 5). Seit Yamanaka und Kollegen 2006 erstmals das Konzept der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) vorstellten [214], ist die personalisierte regenerative Medizin auf der Basis von Stammzellen Realität geworden. Aus pluripotenten Stammzellen differenzierte CECs könnten für die Modellierung von Krankheiten und für In-vitro-Tests von Medikamenten verwendet werden. Aufgrund der geringen Abstoßungsrate von Spendergewebe bei Hornhauttransplantationen konnten sowohl aus embryonalen pluripotenten Stammzellen als auch aus iPSCs erfolgreich CECs in therapeutischer Qualität generiert werden. Diese Hypothese muss jedoch noch bestätigt werden. Durch die Generierung von CECs aus patienteneigenen iPSCs könnte dieses Abstoßungsrisiko weiter reduziert werden. Darüber hinaus werden die aktuellen internationalen Initiativen zur Etablierung homozygoter HLA-iPSC-Banken die logistischen und finanziellen Schwierigkeiten bei der Gewinnung von iPSC von jedem einzelnen Spender überwinden [216]. Insgesamt bietet die Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu CECs mehrere Vorteile, wie die schnellere In-vitro-Expansion pluripotenter Stammzellen im Vergleich zu primär kultivierten CECs und die Unabhängigkeit von Spenderhornhäuten. Allerdings befinden sich die Protokolle zur Gewinnung von CECs aus pluripotenten Stammzellen noch in einem frühen Entwicklungsstadium.

Abb. 5.

Charakterisierung von CECs, die aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. (A) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme mit typischer hexagonaler Zellmorphologie. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigt die Anwesenheit der häufig verwendeten CEC-Marker (B) ZO-1, (C) Na+/K+-ATPase und (D) CD166, die von CECs exprimiert werden, die aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnen wurden. Repräsentative Daten der humanen embryonalen Stammzelllinie Regea08/017. Die Skala beträgt 200 μm. Diese Abbildung wurde freundlicherweise von Pyry Grönroos aus dem Labor von Professor Heli Skottman zur Verfügung gestellt.

Abb. 5.

Charakterisierung von CECs, die aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. (A) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme mit typischer hexagonaler Zellmorphologie. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigt die Anwesenheit der häufig verwendeten CEC-Marker (B) ZO-1, (C) Na+/K+-ATPase und (D) CD166, die von CECs exprimiert werden, die aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnen wurden. Repräsentative Daten der humanen embryonalen Stammzelllinie Regea08/017. Die Skala beträgt 200 μm. Diese Abbildung wurde freundlicherweise von Pyry Grönroos aus dem Labor von Professor Heli Skottman zur Verfügung gestellt.

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Ein intuitiver Weg, ein Protokoll für die Differenzierung pluripotenter Stammzellen, seien es embryonale oder iPSC, in CECs zu entwerfen, besteht darin, einen an die Entwicklungsbiologie angelehnten Ansatz zu wählen. CECs entstehen während der Em­bryonalentwicklung aus der Neuralleiste [126], und die meisten bisher veröffentlichten Protokolle differenzieren pluripotente Stammzellen nach einer anfänglichen Induktion der Neuralleiste in CEC-ähnliche Zellen [4, 31, 58, 62, 67, 91, 124, 132, 208, 235, 257]. Ansätze zur Generierung einer Neuralleisten-ähnlichen Population aus humanen pluripotenten Stammzellen konzentrieren sich auf die Hemmung des SMAD-Signalweges mithilfe des ALK5/TGF-β-Typ-I-Rezeptorkinase-Inhibitors SB431542 in Kombination mit dem Knochenmorphogeneseprotein-Antagonisten Noggin [4, 132, 208] oder den Wnt-Signalwegregulatoren IWP2 und CHIR99021 [58, 62, 124, 235]. Interessanterweise scheint die duale SMAD-Inhibition mit SB431542 und Noggin keine intuitive Methode zur Induktion eines Neuralleisten-ähnlichen Zustands zu sein, da sie allgemein als Methode zur Induktion des Neuroektoderms angesehen wird [29, 107, 171]. Sobald das Neuralleistenstadium erreicht ist, gibt es verschiedene Ansätze zur Induktion der CEC-Linie. Erstens führt die Exposition der Zellen gegenüber Thrombozytenwachstumsfaktor B (PDGF-B), Dickkopf-related Protein 2 (DKK2) und basischem Fibroblastenwachstumsfaktor zur Bildung konfluierender hexagonaler Zellen mit CEC-ähnlichem Phänotyp [4, 132, 208, 235]. Eine Kombination von SB431542 mit dem ROCK-Inhibitor H-1125 kann ebenfalls CEC-ähnliche Zellen erzeugen [257]. Darüber hinaus konnte in einer Studie von Skottman und Kollegen die Bedeutung der Retinsäure für die weitere Differenzierung von Neuralleisten-ähnlichen Zellen zu CEC-ähnlichen Zellen gezeigt werden [62]. Die Verwendung einer rekombinanten Lamininbeschichtung anstelle des tierischen Matrigels könnte ferner die unerwünschte Variabilität von Charge zu Charge verringern und eine xenogenfreie Kultivierung ermöglichen [62].

Die Verwendung von konditionierten Medien für Primärzellen hat sich ebenfalls als erfolgreich für die Differenzierung von Neuralleisten-ähnlichen Zellen zu CEC-ähnlichen Zellen erwiesen [58, 208]. Ein ähnlicher Differenzierungsansatz wurde verwendet, um pluripotente Stammzellen von Nagetieren über das Neuralleisten-ähnliche Stadium zu CECs zu differenzieren [31, 67, 91].

Obwohl der entwicklungsbiologische Ansatz intuitiv erscheint, werden auch konkurrierende Ansätze zur Induktion einer direkten Differenzierung ohne Durchlaufen des Neuralleisten-Vorläuferstadiums untersucht [34, 66, 118, 256]. Die direkte Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in CEC-ähnliche Zellen wurde durch die Verwendung von mit primären Zellkulturen konditionierten Medien [34, 256], durch die Induktion spontaner Differenzierung durch Aussaat der Zellen in Hornhautscheiben [66] oder durch die Verwendung eines definierten Mediums, das Choleratoxin, Epithelwachstumsfaktor und den ROCK-Inhibitor Y-27632 enthält [118], beschrieben.

In den letzten Jahren wurden dank engagierter Bemühungen bezüglich der Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in CECs bedeutende Fortschritte erzielt. Eine der größten Herausforderungen ist die Reinheit der Zellen. Angesichts des Potenzials dieser Zellen können während der Differenzierung unerwünschte Nebenpopulationen auftreten, die aufgrund der geringen Effizienz der derzeitigen Protokolle häufig von Charge zu Charge variieren. Da die Differenzierungsprotokolle sehr komplex sind, sollte die Charakterisierung mit einer Reihe von Markern für jedes Differenzierungsstadium durchgeführt werden. Zur Identifizierung der frühen Neuralleiste oder des periokulären Mesenchyms sollte p75 [134] oder Pitx2 [109] nachgewiesen werden. Schließlich könnte die kürzliche Identifizierung von CEC-Markern wie CD166 und sPrdx6 [42], vergleichbar mit ΔNp63α oder Keratin 12 in Hornhautepithelzellen, die Möglichkeit eröffnen, Zellpopulationen anzureichern, die diese Marker exprimieren, und die derzeitigen Differenzierungsprotokolle zu verbessern.

Neben der Reinheit gibt es eine Reihe weiterer Herausforderungen. Es muss unbedingt nachgewiesen werden, dass die differenzierten Zellen funktionsfähig und sicher und somit für eine therapeutische Anwendung geeignet sind. Eine funktionelle Charakterisierung ist erforderlich, um die aktive metabolische Pumpaktivität zu bestätigen. Es ist auch noch nicht vollständig geklärt, wie sich die Differenzierungsprotokolle auf die (epi)genomische Signatur der Zellen auswirken und ob sie in den Zellen zu DNA-Veränderungen wie epigenetischen Modifikationen und Karyotyp-Anomalien führen. Schließlich muss nachgewiesen werden, dass die Differenzierung vollständig ist und die erzeugten Zellen keine Stammzell-assoziierte Pluripotenz aufweisen, die zu einem tumorigenen Potenzial führen könnte. Wissenschaftler, die aus pluripotenten Stammzellen abgeleitete CECs für therapeutische Zwecke einsetzen wollen, sollten sich insbesondere auf die Untersuchung und Beantwortung der oben genannten Fragen konzentrieren.

Andere Zellquellen

Die Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu CECs gilt als vielversprechende Methode zur Gewinnung einer Quelle therapeutischer Zellen für die regenerative Medizin. Es gibt immer mehr und vielversprechende Hinweise darauf, dass die Entwicklung von Tumoren kein inakzeptables Risiko für die Therapie darstellt, aber dieser Einwand muss sorgfältig geprüft werden. Darüber hinaus erschwert die Schwierigkeit, reine Populationen von CECs aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, ihren Einsatz in einem therapeutischen Umfeld. All dies sind Gründe, andere Zellquellen in Betracht zu ziehen.

Die Transdifferenzierung ist eine Methode zur schnellen und reproduzierbaren Herstellung von CECs mit therapeutischem Potenzial ohne die Risiken und Schwierigkeiten, die mit der Differenzierung pluripotenter Stammzellen verbunden sind. Dabei werden reife somatische Zellen in Zellen einer anderen reifen somatischen Abstammungslinie reprogrammiert. Verschiedene Zelltypen wurden zu CEC-ähnlichen Zellen transdifferenziert, die ein Hornhautödem im Kaninchen-Tiermodell rückgängig machen können. Dazu gehören endotheliale Vorläuferzellen aus dem Knochenmark [201], Neuralleistenzellen [91] und Stammzellen aus dem Hornhautstroma [67]. Interessanterweise wurden auch Progenitorzellen aus der Haut [81, 202] und mesenchymale Stammzellen [246] in einem Prozess, der einer umgekehrten EndMT ähnelt, zu CECs transdifferenziert. Für die Umsetzung solcher Ansätze in einem therapeutischen Umfeld ist es von entscheidender Bedeutung, die Stabilität der Transdifferenzierung nachzuweisen, um eine sichere Therapie zu gewährleisten und die Rückkehr der Zellen zu ihrem somatischen Ursprung zu vermeiden, indem die Effizienz der Transdifferenzierung und die Reinheit der bestehenden Protokolle verbessert werden.

Joyce et al. [87] verfolgten einen anderen Ansatz: Sie verwendeten humane mesenchymale Stammzellen, um das geschädigte Endothel der menschlichen Hornhaut ex vivo zu heilen. Sie zeigten, dass humane mesenchymale Stammzellen die Fähigkeit besitzen, sich an das Hornhautendothel anzuheften und es neu zu besiedeln. Möglicherweise unterstützen sie die umgebenden CECs parakrin und stellen so die Hornhautendothelbarriere wieder her. Trotz der erfolgreichen vorläufigen Ergebnisse sind weitere Studien notwendig, um die Interaktionen dieser Zellen mit ihrer Umgebung zu identifizieren und herauszufinden, wie ihre genetische und phänotypische Signatur mit dem nativen Hornhautendothel korreliert.

Notwendigkeit der Standardisierung von Endpunkt-Parametern

Unabhängig davon, welcher Ansatz zur Generierung von Zellen für die regenerative Medizin gewählt wird, sei es die primäre Expansion aus Spenderzellen, die Ableitung aus pluripotenten Stammzellen oder die Verwendung anderer Zellquellen, ist es von entscheidender Bedeutung, einen Konsens über die Endpunkt-Parameter zur Bewertung ihrer Qualität zu erzielen. In diesem Abschnitt geben wir einen Überblick über die Bewertungskriterien, die erzeugte CECs erfüllen sollten, um für therapeutische Zwecke verwendet werden zu können.

Morphologie

Ein Parameter, der leicht bewertet werden kann, ist die Morphologie der erzeugten CECs. Eine hexagonale Zellmorphologie bei Erreichen der Konfluenz in der Kultur könnte bewertet werden, um das Vorhandensein einer spindelförmigen Fibroblastenmorphologie in Verbindung mit einem mesenchymalen Übergang auszuschließen. Die Bewertung des Zirkularitätsindexes der erzeugten Zellen, der die Hexagonalität und einen geringen Polymorphismus bestätigt, ist eine Qualitätskontrolle, die durchgeführt werden sollte [163, 164, 174, 179]. Darüber hinaus konnten Yamamoto et al. [245] physikalische interzelluläre Interaktionen in einem 2-dimensionalen In-vitro-System mit einer verbesserten Regeneration des Hornhautendothels nach Zellinjektion korrelieren. Dies könnte als Instrument genutzt werden, um einen physikalischen Marker mit der Eignung der erzeugten Zellen für den therapeutischen Einsatz zu korrelieren.

Genotyp und Phänotyp

Für den Einsatz in der regenerativen Medizin sollten CECs eine Gen- und Proteinexpression aufweisen, die mit der von nativen humanen CECs vergleichbar ist. Wie bereits von Van den Bogerd et al. [230] beschrieben, sind die am häufigsten verwendeten Marker zur Charakterisierung der produzierten CECs die Na+/K+-ATPase (ATP1A1), ZO-1 (TJP1) und Kollagen Typ VIII (COL8). Diese Marker sind wichtige Indikatoren für das Vorhandensein von metabolisch aktiven Transportern, die Produktion von ex­trazellulärer Matrix bzw. die Existenz von Tight Junctions, werden aber nicht spezifisch im Hornhautendothel exprimiert, sondern auch in vielen anderen Zelltypen wie dem Lungen- [14] oder Darmepithel [211] und sogar in Hornhautepithelzellen [71]. Der hexagonale Phänotyp ist nicht einmal ausschließlich auf die CECs des Auges beschränkt, sondern tritt auch im retinalen Pigment­epithel auf. Für eine bessere Charakterisierung der erzeugten Zellen ist es daher von größter Bedeutung, die Expression spezifischer Marker für das Hornhautendothel nachzuweisen. CD166 [42, 43, 149] und sPrdx6 [42] (Abb 6) wurden kürzlich als CEC-Marker in der Hornhaut identifiziert, die mit Therapieerfolg korrelieren. Zudem konnte in einer aktuellen Studie von Thuret und Kollegen gezeigt werden, dass die hexagonale Form der apikalen CEC-Oberfläche und die verzahnte Form der basalen CEC-Seite zusammen mit der Expression von funktionellen und strukturellen Proteinen wie CD56, CD166, Vimentin, N-Cadherin und Integrin a3b1 wichtige Merkmale humaner CECs sind [71].

Abb. 6.

Unabhängig davon, woher die für die Therapie geeigneten CECs stammen, ob aus Primärkulturen oder aus pluripotenten Stammzellen, ist es von entscheidender Bedeutung, Strategien zu entwickeln, um sie lebend und mit ausreichendem Adhäsionspotenzial an die Hornhautrückfläche zu transferieren. Derzeit untersuchte Ansätze zur Verabreichung von CECs sind die Injektion von Zellen in die vordere Augenkammer und die Verwendung verschiedener Substrate für das Bioengineering von Hornhautendotheltransplantaten. Diese schematische Übersicht verdeutlicht die Unterschiede zwischen diesen Ansätzen für eine effiziente Bereitstellung von CECs.

Abb. 6.

Unabhängig davon, woher die für die Therapie geeigneten CECs stammen, ob aus Primärkulturen oder aus pluripotenten Stammzellen, ist es von entscheidender Bedeutung, Strategien zu entwickeln, um sie lebend und mit ausreichendem Adhäsionspotenzial an die Hornhautrückfläche zu transferieren. Derzeit untersuchte Ansätze zur Verabreichung von CECs sind die Injektion von Zellen in die vordere Augenkammer und die Verwendung verschiedener Substrate für das Bioengineering von Hornhautendotheltransplantaten. Diese schematische Übersicht verdeutlicht die Unterschiede zwischen diesen Ansätzen für eine effiziente Bereitstellung von CECs.

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Wichtig ist auch das Fehlen von Fibroblastenmarkern, die mit EndMT oder stromaler Fibroblastenkontamination assoziiert sind, nämlich CD44 oder CD73 [149]. Um festzustellen, ob die erzeugten CECs von ausreichender Qualität sind, um in der regenerativen Medizin eingesetzt zu werden, sollte die Charakterisierung durch die Auswertung eines Sets verschiedener Marker erfolgen. Ein Beispiel hierfür ist das von Kinoshita und Kollegen entwickelte und verwendete Panel [101, 223, 227]. Sie berichteten, dass CD166+ CD24 CD26 CD44 CD105 CD133- Zellen die richtige Genexpression und den richtigen Phänotyp haben, um in der Therapie eingesetzt zu werden. In diesem Panel wurde CD166 als Marker für CECs verwendet und die negativen Maker wurden analysiert, um den Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp auszuschließen [101, 223, 227].

Karyotyp

Während der Expansion der primären CECs werden diese angeregt, ihre immobilisierte Phase zu verlassen und sich zu vermehren. Dies kann zu karyotypischen Anomalien im Genom führen [65, 140]. Die Erzeugung und Kultivierung von iPSCs kann auch zu Karyotypanomalien [213] und seltener zur Aneuploidie [61, 182] führen. Um nachzuweisen, dass die Zellen in der regenerativen Medizin sicher verwendet werden können, ist es wichtig, zu bestätigen, dass sie nach der Manipulation einen normalen und sicheren Karyotyp behalten.

Kinoshita et al. legten den Grundstein für eine klinische Studie mit primär expandierten CECs und überwachten den Karyotyp der Zellen während der primären Expansion. Es wurde jedoch kein Endpunkt definiert, der einen für die therapeutische Anwendung geeigneten Karyotyp darstellt [101]. In Singapur wird eine Charge kultivierter CECs als ungeeignet für die Therapie angesehen, wenn eine klonale Chromosomenaddition oder -deletion vorliegt, z.B. mehr als 2 Metaphasezellen mit der gleichen chromosomalen Trisomie oder mehr als 3 Zellen mit der gleichen monosomalen Anomalie oder mehr als 20 Zellen in der Metaphase [222].

Funktionalität

Um die Entwässerung der Hornhaut und ihre Transparenz aufrechtzuerhalten, muss nachgewiesen werden, dass die erzeugten Zellen eine aktive metabolische Pumpaktivität besitzen. Die Expression von Transportern, z.B. der Na+/K+-ATPase oder des elektrogenen Natriumbicarbonat-Cotransporters 1 (SLC4A4), ist allein kein ausreichender Beweis für die Funktionalität, da die Proteinexpression nicht notwendigerweise mit einer aktiven Stoffwechselpumpe in den Zellen korreliert. Bisher wurden In-vitro-, Ex-vivo- und In-vivo-Methoden entwickelt, um die Funktionalität von CECs zu testen.

Eine schnelle Möglichkeit, die Funktionalität nachzuweisen, ist ein In-vitro-Test, der den aktiven Transport von Metaboliten, d.h. den Ionentransport, durch eine Monolage von CECs zeigen soll. Die am häufigsten verwendeten Methoden sind die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) [57] und die Ussing-Kammer-Messung [7, 67, 138, 256]. Während die erste Methode nicht notwendigerweise den Transport misst, ist Letztere wegen der Empfindlichkeit gegenüber äußeren Faktoren (Abstand der Elektroden von der Messmembran, Empfindlichkeit der Zellmonolayer gegenüber Temperatur, pH-Änderungen und Zellablösung, Empfindlichkeit der Instrumente gegenüber Vibrationen) schwierig durchzuführen.

Eine weitere Möglichkeit zur Beurteilung der Funktionalität von CECs ist die Beurteilung ihrer aktiven Reparatur in Ex-vivo-Hornhäuten. Die Kultivierung von Ex-vivo-Hornhäuten in einer Umgebung, die physiologische Bedingungen nachahmt, ermöglicht die Messung der Hornhautdicke und deren Korrelation mit der Zellfunktionalität [1, 191]. Um die physiologischen Bedingungen in einer menschlichen Hornhaut ex vivo vollständig zu imitieren, haben Thuret und Kollegen einen Bioreaktor entwickelt, der die Möglichkeit eröffnet, Ex-vivo-Hornhäute für funktionelle Tests zu verwenden (Abbildung abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987) [63].

Schließlich wurden auch Tiermodelle für Hornhautödeme verwendet, um die Zellfunktion zu testen, indem der Rückgang des induzierten Hornhautödems gemessen wurde [24, 54, 103, 190]. Je nach dem gewählten Modell und aufgrund der physiologischen Unterschiede zwischen den Arten ist es wichtig, die erforderlichen Kontrollen durchzuführen. Das Kaninchen eines der am häufigsten verwendeten Tiermodelle, es besitzt allerdings ein selbstheilendes Hornhautendothel. Tiermodelle sind eine wertvolle Methode zur Überprüfung der Sicherheit und Wirksamkeit bei der Erforschung und Entwicklung von Zelltherapien [54]. Die verwendeten Tiermodelle sind jedoch nur für die bullöse Keratopathie repräsentativ, wobei gute FECD-Modelle fehlen. Schließlich ist es ethisch nicht vertretbar, routinemäßig Tiermodelle als Qualitätskontrolle zu verwenden, um jede Charge erzeugter Zellen vor ihrer klinischen Verwendung zu testen.

Der Nachweis der CEC-Funktionalität ist wahrscheinlich die wichtigste Voraussetzung für ein erfolgreiches regeneratives Arzneimittel. Es gibt keinen perfekten Test, aber eine Kombination von Methoden ermöglicht eine genaue Beurteilung des Problems. Es besteht jedoch nach wie vor die Notwendigkeit, einfache funktionelle Testplattformen zu entwickeln, die für die Qualitätskontrolle vor der therapeutischen Verwendung jeder CEC-Charge eingesetzt werden können. Die Organ-on-a-Chip-Technologie [255] besteht aus mikrofluidischen Zellkulturchips, die physiologische Reaktionen von Organen erfolgreich nachahmen können. Ein solches System ist ein interessanter Kandidat für die Entwicklung eines funktionellen Hochdurchsatzmodells der kornealen Endothelbarriere, das systematisch als Qualitätskontrolle für jede Charge erzeugter CECs eingesetzt werden kann.

Fortschritte in der Primärkultur von CECs, der Differenzierung pluripotenter Stammzellen und der Erzeugung von CECs aus anderen Zellquellen sind vielversprechende Ansätze für die Entwicklung einer zellulären Therapie zur Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen. Ihr Erfolg hängt jedoch von einer geeigneten Methode ab, mit der sie in die Hornhaut eingebracht werden (Abb 6). Die Zellen müssen lebend und mit ausreichendem Adhäsionspotenzial an die Hornhautrückfläche transferiert werden. Die beiden wichtigsten Methoden, die derzeit für die Verabreichung von CECs untersucht werden, sind die Injektion von Zellen in die vordere Augenkammer und die Verwendung verschiedener Substrate für das Bioengineering von Hornhautendotheltransplantaten [54].

Zellinjektion

Bei der Zellinjektion werden CECs auf einfache und minimalinvasive Weise durch Injektion in die vordere Augenkammer verabreicht (Abb 7). Anfang der 2000er Jahre legten Mimura et al. den Grundstein für die Verabreichung von primär kultivierten CECs durch intrakamerale Injektion in ein Kaninchenmodell der bullösen Keratopathie [136, 139]. Nach diesem Machbarkeitsnachweis wurde die Technik der CEC-Verabreichung durch Zellinjektion weiter optimiert.

Abb. 7.

Die funktionelle Evaluierung von 2 Verabreichungsmethoden für CECs zeigt, dass diese sowohl durch Zellinjektion als auch mit einem Zellträger erfolgreich übertragen werden können. (A, B) Primäre kultivierte humane CECs wurden 2 Kaninchenmodellen mit bullöser Keratopathie entweder mit einem stromalen CEC-Träger (TE-EK) oder einer Zellinjektion (CE-CI) verabreicht und zeigten eine vergleichbare Reduktion des Hornhautödems. In der Kontrollgruppe B wurde das Hornhautendothel ohne Behandlung entfernt. In der Kontrollgruppe C wurde das Hornhautendothel nach Transplantation mit dem Träger ohne Zellen entfernt. In Kontrollgruppe 2 wurde das Hornhautendothel nach Injektion von CECs entfernt. In Kontrollgruppe 3 wurde das Endothel nach Behandlung mit Y-27632 (ROCK-Inhibitor) enthaltenden Augentropfen entfernt. (C) Spaltlampenaufnahmen von Kaninchenaugen vor dem klinischen Eingriff (präoperativ) sowie 1 und 3 Wochen nach dem klinischen Eingriff zeigen die Wiederherstellung der Transparenz bei Hornhäuten, die entweder mit CE-CI oder TE-EK behandelt wurden. (D) Die Alizarinrot-Färbung von Kaninchenhornhäuten, die mit TE-EK oder CE-CI behandelt wurden, zeigt ein Mosaik von CECs. Kaninchenhornhautendothelschnitte und Kaninchenhornhautstromaschnitte wurden als Kontrollen ebenfalls gefärbt (D).

Abb. 7.

Die funktionelle Evaluierung von 2 Verabreichungsmethoden für CECs zeigt, dass diese sowohl durch Zellinjektion als auch mit einem Zellträger erfolgreich übertragen werden können. (A, B) Primäre kultivierte humane CECs wurden 2 Kaninchenmodellen mit bullöser Keratopathie entweder mit einem stromalen CEC-Träger (TE-EK) oder einer Zellinjektion (CE-CI) verabreicht und zeigten eine vergleichbare Reduktion des Hornhautödems. In der Kontrollgruppe B wurde das Hornhautendothel ohne Behandlung entfernt. In der Kontrollgruppe C wurde das Hornhautendothel nach Transplantation mit dem Träger ohne Zellen entfernt. In Kontrollgruppe 2 wurde das Hornhautendothel nach Injektion von CECs entfernt. In Kontrollgruppe 3 wurde das Endothel nach Behandlung mit Y-27632 (ROCK-Inhibitor) enthaltenden Augentropfen entfernt. (C) Spaltlampenaufnahmen von Kaninchenaugen vor dem klinischen Eingriff (präoperativ) sowie 1 und 3 Wochen nach dem klinischen Eingriff zeigen die Wiederherstellung der Transparenz bei Hornhäuten, die entweder mit CE-CI oder TE-EK behandelt wurden. (D) Die Alizarinrot-Färbung von Kaninchenhornhäuten, die mit TE-EK oder CE-CI behandelt wurden, zeigt ein Mosaik von CECs. Kaninchenhornhautendothelschnitte und Kaninchenhornhautstromaschnitte wurden als Kontrollen ebenfalls gefärbt (D).

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Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass die Schwerkraft die Adhäsion von CECs am hinteren Teil der Hornhaut erhöht. Nach der Zellinjektion müssen die behandelten Tiere 2–3 Stunden in Bauchlage bleiben, damit sich die CECs festsetzen können [137, 154]. Die gleichzeitige Verabreichung der Zellen mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in Kombination mit der Bauchlage des Empfängers verbesserte die Zelladhäsion signifikant [154, 152, 177]. Eine andere Strategie untersuchte die Erhöhung der Adhäsion von CECs durch die Nutzung magnetischer Kräfte unter Verwendung von Zellen, die mit ferromagnetischen Kügelchen beladen waren [136, 144, 173].

In der bahnbrechenden ersten klinischen Studie am Menschen mit primären kultivierten CECs konnten Kinoshita et al. [101] das Hornhautödem bei Patienten mit bullöser Keratopathie nach Kataraktoperation und bei FECD-Patienten durch Injektion von primären kultivierten CECs zusammen mit Y-27632 umkehren. Die hervorragende klinische Studie von Kinoshita et al. war ein wichtiger Meilenstein in der Entwicklung einer Zelltherapie zur Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen und hat dazu beigetragen, die Aspekte zu identifizieren, die für eine effiziente und sichere Therapie beachtet werden müssen. In der jüngsten 5-Jahres-Follow-up-Studie blieb die klinische Rückbildung der Endothelerkrankung bei 10 von 11 Patienten erhalten [147]. Diese bahnbrechende klinische Studie warf eine Reihe von Fragen auf. Interessanterweise wurden 2 verschiedene Protokolle zur primären CEC-Expansion mit und ohne den TGF-β-Inhibitor SB431542 und 2 verschiedene Techniken zur Entfernung des geschädigten Hornhautendothels verwendet [228, 229]. Zudem erhielt ein Empfänger eine Injektion von 5 × 105 Zellen, während die anderen Empfänger eine Injektion von 1 × 106 Zellen erhielten, was einen weiteren variablen Faktor während der klinischen Studie darstellte. Die CEC-Dichten der Empfänger 24 Wochen nach der Injektion reichten von 947 bis 2833 Zellen/mm2, mit einer durchschnittlichen Dichte von 1924 Zellen/mm2 [101], die nach 5 Jahren auf eine durchschnittliche CEC-Dichte von 1257 Zellen/mm2 zurückging [147]. Es wäre interessant zu verstehen, wie Spender- und Patientencharakteristika diesen Parameter beeinflussen könnten und ob die Verwendung von postoperativen ROCK-Inhibitoren den Verlust von CECs nach der Injektion verringern könnte.

Bei fortgeschrittener FECD, bei der die Descemet-Membran durch Guttae verändert ist, sind die Adhäsion der CECs und die Bildung von Monolayern stark beeinträchtigt [102, 187]. Dies kann zu Komplikationen bei der Behandlung dieser Patienten mit Zellinjektionen führen. In der klinischen Studie von Kinoshita et al. wurden 7 Patienten mit FECD behandelt und die Guttae schienen sich nach 2 und 5 Jahren nicht zu verbessern.

Okumura et al. [155] führten eine Machbarkeitsstudie durch, in der sie die Ergebnisse der Injektion von CECs in 2 Kaninchenmodellgruppen verglichen: In der ersten Gruppe wurden die CECs abgeschabt, wobei die Descemet-Membran intakt blieb, in der zweiten Gruppe wurde eine Descemetorhexis mit einem Durchmesser von 4 mm durchgeführt. Nach 14 Tagen waren die Hornhautdicke und Transparenz in beiden Gruppen vergleichbar, wenngleich die Erholung in der Descemetorhexis-Gruppe langsamer verlief [155]. In einer neueren Studie von Mehta und Kollegen wurde die Injektion von CECs ebenfalls in 2 Kaninchenmodellen durchgeführt: In der ersten Gruppe wurden die CECs abgeschabt, wobei die Descemet-Membran intakt blieb, während in der zweiten Gruppe eine vollständige Descemetorhexis durchgeführt wurde [177]. Interessanterweise waren die Hornhäute in der Gruppe mit vollständiger Descemetorhexis, die eine CEC-Injektion erhielt, nach 3 Wochen immer noch geschwollen und wiesen eine Dicke von etwa 850 μm auf, während die Hornhaut in der Gruppe mit intakter Descemet-Membran, die eine CEC-Injektion erhielt, auf 582 μm geschrumpft war [177]. Diese Studien deuten darauf hin, dass das Vorhandensein der Descemet-Membran in der Empfängerhornhaut entscheidend für den Erfolg der CEC-Injektion ist. Dennoch könnte die partielle und kontrollierte Entfernung veränderter Teile der Descemet-Membran, gefolgt von einer CEC-Injektion, eine Option zur Behandlung der FECD sein.

Die Zellinjektion ist noch keine effiziente Methode in Bezug auf die Anzahl der verwendeten Zellen. Die Anzahl der üblicherweise verwendeten CECs, 1 × 106 Zellen pro Hornhaut, ist etwa 4–5-mal höher als die Zellzahl im gesunden menschlichen Hornhaut­endothel. Nach unseren Berechnungen können CECs, die von einem einzigen Spender isoliert wurden, bis zur zweiten Passage auf 5 × 106 bis 10 × 106 Zellen in Konfluenz expandieren. Nimmt man die Anzahl der Zellinjektionen aus der klinischen Studie von Kinoshita et al. (1 × 106 Zellen pro Hornhaut), so könnten hypothetisch 5–10 Patienten mit einem einzigen Spender behandelt werden. Eine Verbesserung der Zelladhäsion und des Zellüberlebens während des Verfahrens würde die Anzahl der Zellen verringern, die für die Behandlung einer erkrankten Hornhaut benötigt werden, sodass mehr Patienten von dieser Technik profitieren könnten. Dies kann durch Strategien wie die Isolierung von CECs aus für die Transplantation ungeeigneten Geweben für die direkte Zellinjektion ergänzt werden ([159], Abschnitt «Primärkultur von Endothelzellen der Hornhaut»).

Darüber hinaus muss verstanden werden, wie sich nicht adhärierte CECs verteilen. Bisher gibt es nur wenige Studien, die die biologische Verteilung von injizierten CECs und ihre möglichen Wirkungen sowohl im Auge des Empfängers als auch systemisch zeigen. Brunette und Kollegen beschrieben die Ablagerung von Zellen hinter der Linsenkapsel nach CEC-Injektion [24]. Die Fähigkeit von CECs, das Trabekelwerk des Auges zu passieren und sich systemisch im Körper zu verteilen, scheint unwahrscheinlich [157]. Wenngleich ein Patient nach der CEC-Injektion ein schweres Glaukom erlitt, war dies wahrscheinlich auf die Einnahme von Steroiden zurückzuführen, und obwohl das Trabekelwerk nach der Gonioskopie nicht verstopft war, könnten die CECs von Makrophagen entfernt worden sein, die dann den Abfluss blockierten. Schließlich ist es möglich, dass die Regeneration des Hornhautendothels bei Patienten mit FECD auf patienteneigene CECs zurückzuführen ist, die durch den ROCK-Inhibitor und nicht durch die injizierten Zellen induziert werden. Um diese Möglichkeit auszuschließen, könnte in zukünftigen Studien eine Kontrollgruppe bestehend aus einem DSO/DWEK-Verfahren mit und ohne ROCK-Inhibitor in Betracht gezogen werden.

Derzeit laufen weltweit 3 klinische Studien zur Injektion von primär kultivierten humanen CECs, die in Kürze wertvolle neue Daten für den therapeutischen Einsatz dieser Technologie liefern werden. Dazu gehören eine klinische Studie der Phase I (Identifikationsnummer NCT04191629), in der die Verabreichung von primär kultivierten CECs mit ferromagnetischen Beads in Mexiko untersucht wird, sowie 2 klinische Studien der Phase III (Identifikationsnummern UMIN000034334 und UMIN000012534), in denen die Injektion von CECs in Japan weiter untersucht wird.

Hornhautendothel aus Gewebezüchtung (Tissue Engineering)

Eine weitere Strategie zur Bereitstellung von CECs ist die Verwendung von Trägern oder Scaffolds zur Erzeugung von biotechnologisch hergestellten Hornhautendotheltransplantaten (Abb 7). Der Vorteil dieser Strategie liegt darin, dass die Zellen kontrolliert an den richtigen Ort gebracht werden können, nachdem sie bereits eine konfluente Zellschicht gebildet haben, die bereit ist, ihre Arbeit aufzunehmen. Darüber hinaus würde die Verwendung von Trägern oder Scaffolds die Anzahl der benötigten Zellen im Vergleich zur Zellinjektion verringern und damit die Anzahl der Patienten erhöhen, die von der Therapie profitieren könnten. Basierend auf unseren Berechnungen, dass die CECs eines einzelnen Spenders auf 5 × 106 bis 10 × 106 Zellen expandiert werden können, und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass ein Hornhaut­endotheltransplantat aus etwa 2 × 105 CECs bestehen sollte, schätzen wir, dass mit dieser Methode 25–50 Patienten mit Gewebe von einem einzelnen Spender behandelt werden könnten. Im Gegensatz zur Zellinjektion, deren Potenzial zur Behandlung der FECD noch unklar ist, könnte diese Strategie ähnlich wie DSAEK oder DMEK zur Behandlung der meisten Hornhauterkrankungen eingesetzt werden. Im Vergleich zur Zellinjektion ist dieser Ansatz jedoch mit zusätzlichen Herausforderungen verbunden.

Um ein Hornhautendotheltransplantat biotechnologisch herzustellen, muss das Substrat oder Material bestimmte Anforderungen erfüllen. Es sollte stark genug sein, um chirurgischen Eingriffen standzuhalten, ohne zu brechen, und eine Dicke aufweisen, die mit der von DSAEK oder DMEK vergleichbar ist. Das gewählte Scaffold sollte transparent sein und einen Brechungsindex von etwa 1,38 aufweisen, um der Hornhaut zu entsprechen [172], und für Ionen, Nährstoffe und Stoffwechselprodukte wie Milchsäure durchlässig sein. Ebenso wichtig ist, dass es die Adhäsion und den Phänotyp der CECs fördert, aber auch am Hornhautstroma des Empfängers haftet. Es ist unbedingt darauf zu achten, dass der gewählte Träger keine fibrotischen Reaktionen hervorruft, die das Auge des Empfängers schädigen könnten. Auch wenn nicht unbedingt erforderlich, ist die biologische Abbaubarkeit ein attraktives Merkmal, da die transplantierten Zellen ihre eigene Descemet-Membran bilden, während der Träger langsam abgebaut wird.

Gegenwärtig gibt es 2 Hauptkategorien von Trägermaterialien für CECs: biologische Scaffolds, die aus Gewebe gewonnen werden, und synthetische oder künstliche Scaffolds. Alternativ versuchen einige Forschergruppen, biotechnologisch hergestellte endotheliale Monolayer zu entwickeln, die nur aus CECs und ihrer extrazellulären Matrix bestehen, indem die Zellen auf thermoresponsiven Gelsubstraten kultiviert werden. In diesem Abschnitt werden die wichtigsten Vorteile der verschiedenen Strategien für das Bioengineering von Hornhautendotheltransplantaten diskutiert.

Biologische Scaffolds

Biologische Scaffolds sind aus Gewebe gewonnene CEC-Träger, die in der Regel durch Dezellularisierung biologischer Membranen oder durch Dezellularisierung und Modifizierung biologischer Matrizes hergestellt werden. Das Ergebnis ist ein Scaffold, das als Zellträger verwendet werden kann (Tabelle 1 abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987).

Als Scaffolds für CECs wurden die hinteren Lamellen der Rinderhornhaut [17], die Descemet-Membran vom Schwein [41], modifiziertes Hornhautstroma vom Schwein [256] und modifizierte Fischschuppen [170] verwendet. Ihr xenogener Ursprung könnte jedoch zu Skepsis Anlass geben, da die Gefahr besteht, dass sie Reste von Zellmaterial enthalten, aber auch, dass sie nicht das beste Medium für menschliche Zellen darstellen.

Als Alternative zu xenogenen Quellen wurden auch dezellularisiertes humanes Gewebe und biologische Membranen als Scaffolds für CECs verwendet. Modifiziertes Spenderhornhautstroma [13, 38, 70, 73, 175, 177] (Abbildung abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987), die Amnionmembran [51, 52, 82], die vordere Linsenkapsel [106, 209, 210, 229, 249] und die Descemet-Membran [210] wurden als Quellen zur Herstellung von CEC-Trägern verwendet.

Unter Berücksichtigung der Daten aus präklinischen Studien waren Stroma-Scaffolds am erfolgreichsten bei der Rückbildung von Hornhautödemen und der Wiederherstellung der Hornhauttransparenz bei Kaninchen [73, 175, 177]. Umgekehrt lösten Träger der vorderen Linsenkapsel starke fibrotische Reaktionen in den Augen von Minischweinen aus [219], während Amnionmembranen bei Katzen nicht zu einem vollständigen Rückgang des Hornhautödems führten [51]. Derzeit läuft in Singapur eine klinische Studie der Phase I (Identifikationsnummer NCT04319848), in der Patienten mit Hornhautendothelerkrankungen primär kultivierte CECs unter Verwendung von dezellularisierten und modifizierten humanen Hornhautstroma-Trägern verabreicht werden. Diese Studie befindet sich in einer frühen Rekrutierungsphase und weitere Informationen werden in den kommenden Jahren verfügbar sein.

Der Vorteil der Verwendung biologischer Scaffolds liegt in ihrem somatischen Ursprung, denn es gibt keine bessere Biokompatibilität als die eines natürlichen Gewebes. Biologische Träger stellen jedoch einige zusätzliche Hindernisse dar. Die Herstellung von CEC-Trägern aus Spendergewebe wird immer von der Verfügbarkeit von Spendern abhängen und erfordert eine geeignete Gewebebank. Länder, die nicht über diese Infrastruktur verfügen, könnten Schwierigkeiten haben, aus Gewebe gewonnene CEC-Träger zu verwenden. Außerdem kann die Variabilität von Spender zu Spender die endgültigen Eigenschaften der erzeugten Träger beeinflussen, und es ist ungewiss, wie sich dies auf die endgültige Therapie auswirken wird.

Polymer-Scaffolds

Polymer-Scaffolds sind CEC-Träger, die aus natürlich vorkommenden Polymeren aus biologischen Quellen oder aus synthetischen Polymeren hergestellt werden können. Durch verschiedene Ansätze wie Vernetzung [129], Spin-Coating [113] und Elektrospinning [196] können diese Materialien zu CEC-Trägern mit Eigenschaften verarbeitet werden, die sowohl vom Polymer als auch vom Herstellungsprozess abhängen (Tabelle 1 abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987). Die Hauptvorteile von Polymer-Scaffolds sind die Unabhängigkeit von Spendergewebe und die Möglichkeit, schnell und reproduzierbar große Mengen an Material zu erzeugen, um ein hochdefiniertes Produkt für den klinischen Einsatz herzustellen. Allerdings kann die Verwendung von Trägermaterialien nichtphysiologischen Ursprungs zu unerwünschten Reaktionen führen.

Häufig verwendete natürliche Polymere sind Kollagen, einschließlich Kollagenvitriol [25, 105, 116, 138, 162, 209, 232, 244, 215, 251], aus Kollagen gewonnene Gelatine [100, 238] und Seidenfibroin [2, 36, 95, 96, 99, 128, 185, 233]. Die Datenlage ist uneinheitlich, und Tierversuche haben die Hauptschwächen dieser Träger aufgezeigt. Beispielsweise haben die Kollagenträger Schwierigkeiten, am Hornhautstroma des Empfängers zu haften, und die Scaffolds neigen dazu, sich nach 2 Wochen abzulösen [105]. In anderen Studien mit kollagenabgeleiteten Trägern wurde die Integration der Träger nicht länger als 2 Wochen nach der Implantation verfolgt [250, 251], sodass die Frage der Integration des Transplantats unbeantwortet blieb.

Auch bei Gelatine-Scaffolds gibt es Probleme mit der Integration. In einer Studie wurde berichtet, dass sich 4 Wochen nach der Implantation 60% der transplantierten Scaffolds vom Hornhautstroma des Empfängers gelöst hatten [100]. Seidenfibroin-Scaffolds wurden ebenfalls in Tiermodellen getestet, lösten aber fi­brotische Reaktionen im Hornhautstroma der Empfängerkaninchen aus [233], sodass sie für den therapeutischen Einsatz ungeeignet sind. Es besteht ein dringender Bedarf, die oben genannten Unzulänglichkeiten dieser Träger zu überwinden, um sie in die klinische Praxis zu überführen.

Viele synthetische Polymere wurden ebenfalls als CEC-Träger untersucht. Beispiele für verwendete synthetische Polymere sind Polycaprolacton (PCL) [108], Polyethylenglykol (PEG) [161], Polymilchsäure (PLA) [231], Chitosan [119], Gelatine-Methacrylat (GelMA) [188], chemisch modifizierte Agarose [199] und Kombinationen von Polymeren wie Seidenfibroin-Glycerin [208] und Chitosan-PCL [237, 252]. Diese synthetischen Ansätze sollen ein gewisses Maß an Flexibilität bei der Gestaltung des Materials ermöglichen, um es an den klinischen Zweck anzupassen, und die Konsistenz bieten, die biologische Scaffolds nicht haben.

Trotz vielversprechender Ergebnisse in Bezug auf die physikalischen Eigenschaften des Trägers, das Überleben der Zellen, die Adhärenz und die Erhaltung des Phänotyps gibt es nur eine In-vitro-Studie mit primär kultivierten CECs [188]. Die Biokompatibilität der anderen untersuchten Träger wurde mit immortalisierten Zelllinien [31, 108, 195, 231] oder primär kultivierten CECs nichthumanen Ursprungs [119, 208, 237, 252] charakterisiert. Um besser zu verstehen, ob die erzeugten Träger eine gute Plattform für die regenerative Medizin darstellen, müssen die Biokompatibilität und die Erhaltung des Phänotyps mit primären kultivierten humanen CECs nachgewiesen werden. Tierversuche sind entscheidend, um zu zeigen, dass die hergestellten Scaffolds in das Hornhautstroma des Empfängers integriert werden können, ohne eine fibrotische Reaktion auszulösen.

Biotechnologisch hergestellte 1-lagige Endothelschichten

Umgekehrt untersuchen verschiedene Gruppen die Möglichkeit, CECs in Form von biotechnologisch hergestellten Endothel-Monolayern zu verabreichen. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass die Transplantate durch die zelleigene extrazelluläre Matrix zusammengefügt werden, wodurch ein vollständig biokompatibles Konstrukt mit geringerem Risiko von Nebenwirkungen bei der Implantation entsteht (Tabelle 1 unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987).

Zur Herstellung solcher Blätter werden CECs auf thermoresponsiven Polymersubstraten kultiviert. Nach Erreichen der Zellkonfluenz und Temperatursenkung löst sich der CEC-Monolayer von der thermoresponsiven Kulturoberfläche ab und bildet ein hochkompaktes Zellblatt oder ein ultradünnes Hornhautendotheltransplantat [80, 110, 127, 212, 217, 218]. Diese biotechnologisch hergestellten Monolayer-Endothelschichten scheinen ein eleganter Ansatz zu sein, um CECs in die Hornhaut einzubringen. Außerdem bieten sie gegenüber Zellträgern einen Vorteil hinsichtlich der Biokompatibilität. Diese hauchdünnen Zellschichten sind jedoch besonders zerbrechlich und ihre Handhabung im Auge kann eine technische Herausforderung darstellen. Es ist von größter Bedeutung, Techniken zu entwickeln, die eine präzise und reproduzierbare Implantation in die Empfängerhornhaut ermöglichen. Es wurde vorgeschlagen, solche Blätter auf Gelatine- oder Hyaluronsäureträger zu laden, um die Handhabung zu erleichtern [77, 111, 112]. Allerdings weist dieser Ansatz Ähnlichkeiten mit der Verwendung von CEC-Trägern und deren potenziellen Biokompatibilitäts- und Integrationsproblemen auf.

Die Entwicklung chirurgischer Techniken wie DSO oder DWEK hat gezeigt, dass in bestimmten Fällen von FECD eine Regeneration des Hornhautendothels auch ohne Verwendung eines Spenderendotheltransplantats erreicht werden kann, was den derzeitigen Stand der Technik infrage stellt. DSO und DWEK sind jedoch auf frühe Krankheitsstadien bei relativ jungen Patienten beschränkt, und die Genesung ist langwierig und unvorhersehbar. Endotheltransplantate aus synthetischen oder gewebeabgeleiteten Matrizes können die Hornhautheilung fördern, wenn sie nach DSO/DWEK-Verfahren implantiert werden. Bei dieser Technik wäre kein Spendertransplantat erforderlich. Der potenzielle Vorteil besteht darin, dass azelluläre Hornhautendotheltransplantate die Proliferation und Migration peripherer CECs zur Neubesiedlung azellulärer Regionen fördern oder erleichtern und auch die Hornhautentwässerung und Ödemreduktion nach der Implantation unterstützen können.

Mehta und Kollegen berichteten 2017 erstmals über die Verwendung von azellulären Hornhautendotheltransplantaten [19]. In ihrer Studie wurde das Hornhautendothel von Kaninchenaugen entfernt und die dezellularisierte menschliche Descemet-Mem­bran ähnlich wie bei einem DMEK-Verfahren eingesetzt, ein Prozess, der als Descemet-Membran-Transfer bezeichnet wird. Die Tiergruppe, die eine allogen dezellularisierte Descemet-Mem­bran erhielt, zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe, die kein allogenes Transplantat erhielt, eine verstärkte Migration des Hornhautendothels und einen schnelleren Rückgang des Ödems (Abbildung abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987). Derzeit läuft in Singapur eine klinische Studie, die diese Technik am Menschen untersucht (Identifikationsnummer NCT03275896). Die ersten klinischen Ergebnisse wurden vor kurzem veröffentlicht. Die erste Transplantation einer dezellularisierten Descemet-Membran mit einem Durchmesser von 4 mm bei einem Patienten führte 6 Monate nach der Transplantation zu einer Verbesserung der bestkorrigierten Sehschärfe nach Snellen von 6/18 auf 6/7,5 [206]. Zudem wurde die Hornhautdicke von 603 auf 569 μm reduziert und die zentrale CEC-Dichte betrug 889 Zellen/mm2 [206]. Diese erste Machbarkeitsstudie ebnet den Weg für die Untersuchung azellulärer Hornhautendotheltransplantate zur Förderung der CEC-Abheilung und Ödemreduktion.

Ein zweiter Ansatz schlug die Verwendung eines synthetischen Transplantatersatzes zur Umkehrung der Hornhautendothelerkrankung vor. Derzeit läuft eine randomisierte, multizentrische klinische Studie (Identifikationsnummer NCT03069521), in der untersucht wird, ob ein Implantat auf der Basis von Contomac Ci26 (EndoArt) die Rückbildung eines Hornhautödems bewirkt und die Wiederherstellung der Sehschärfe fördert. Das EndoArt-Implantat wurde entwickelt, um das Eindringen von Flüssigkeit in die Hornhaut zu verhindern und so ein Hornhautödem zu vermeiden oder rückgängig zu machen. Auch wenn die Daten dieser Studie noch begrenzt sind, sind die vorläufigen Ergebnisse von 8 Patienten mit chronischem Hornhautödem ermutigend [40]. Von diesen 8 Patienten wiesen 7 nach der EndoArt-Implantation eine Reduktion des Hornhautödems und eine Wiederherstellung der Transparenz auf. Bei 1 Patienten scheiterte die Operation aufgrund einer Hypotomie, wobei eine rettende perforierende Keratoplastik durchgeführt wurde. Bei den 7 erfolgreichen Operationen löste sich das Konstrukt von der Hornhaut des Empfängers und musste durch erneutes Aufblasen neu positioniert werden, bis es korrekt auf der Hornhaut fixiert war (Abb 8). Die Hornhaut der 7 Patienten blieb bis zu 4 Monate lang klar.

Abb. 8.

Spaltlampenaufnahme des Auges eines Patienten 1 Tag nach der EndoArt-Implantation. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ruth Lapid-Gortzak, Medizinisches Zentrum der Universität Amsterdam, Niederlande.

Abb. 8.

Spaltlampenaufnahme des Auges eines Patienten 1 Tag nach der EndoArt-Implantation. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ruth Lapid-Gortzak, Medizinisches Zentrum der Universität Amsterdam, Niederlande.

Close modal

Trotz erster positiver Ergebnisse bleibt unklar, wie lange die Hornhaut transparent bleibt und ob erneut ein Hornhautödem auftritt. Weitere Daten sind erforderlich, um die genaue Ablösungsrate zu bestimmen und festzustellen, ob die Undurchlässigkeit des Konstrukts die Hornhauternährung langfristig beeinflusst. Verbesserungen bezüglich der Befestigung des Materials auf der Hornhaut des Empfängers wären notwendig, um eine breite Akzeptanz eines solchen Konstrukts zu ermöglichen. Da­rüber hinaus sind CECs nach den derzeit vorliegenden Daten nicht in der Lage, durch EndoArt zu wandern, und die Folgen davon bleiben noch abzuwarten. Insgesamt bieten azelluläre Transplantatsubstitute zwar eine attraktive Lösung für den derzeitigen Gewebemangel, es sind in Zukunft jedoch weitere Studien erforderlich, um festzustellen, ob und für welche Indikationen sie erfolgreich genug sind, um im großen Umfang klinisch eingesetzt zu werden.

Die pharmakologische Modulation des Hornhautendothels zur Förderung des Zellüberlebens, der Zellproliferation und der Zellmigration wurde ebenfalls als mögliche Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen untersucht und zeigte vielversprechende vorläufige Ergebnisse (Tabelle 2 abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987). Der Vorteil dieser Therapieform liegt darin, dass sich das Endothel der Patienten mit einem minimalen Eingriff durch intrakamerale oder topische Verabreichung eines Medikaments regenerieren könnte. Auch wenn die Risiken einer pharmakologischen Modulation des Hornhautendothels eher gering erscheinen, da es, wenn sich die Patienten nach einem angemessenen Behandlungsfenster nicht erholen, immer noch möglich ist, eine DMEK/DSAEK als Notfallmaßnahme durchzuführen, um eine subepitheliale oder stromale Vernarbung zu vermeiden, ist es wichtig, mögliche Infiltrationen des Trabekelwerks oder die Entwicklung eines iridokornealen Endothel-Syndroms durch das therapeutische Medikament zu überwachen.

Zu den vielversprechendsten Kandidaten für die Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen zählen die ROCK-Inhibitoren. Bei ROCK handelt es sich um eine Proteinkinase, die der Effektor-GTPase Rho nachgeschaltet ist, die eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zytoskeletts spielt. Der erste identifizierte Wirkstoffkandidat war Y-27632, der das Potenzial aufwies, die Reparatur und das Überleben von CECs in vitro zu induzieren [158, 183]. Nachdem in Modellen der bullösen Keratopathie bei Kaninchen und Affen Erfolge bei der Reduktion des Hornhaut­ödems und der Wiederherstellung der Sehschärfe erzielt werden konnten [104, 153], wurde in Japan eine erste klinische Studie durchgeführt (Identifikationsnummer UMIN000003625). Diese Studie umfasste 2 verschiedene Gruppen. Zunächst wurde eine Gruppe von 8 Patienten behandelt, 4 mit FECD und 4 mit bullöser Keratopathie. Die beschädigten CECs wurden vorsichtig chirurgisch entfernt, wobei die Descemet-Membran erhalten blieb. Nach diesem minimalen chirurgischen Eingriff wurden die 8 Patienten 7 Tage lang 6-mal täglich topisch mit 10 mM Y-27632 in Form von Augentropfen behandelt. Die Hornhautdicke wurde 3 und 6 Monate nach der Behandlung gemessen. Bei den 4 Patienten mit FECD-induziertem zentralem Hornhautödem wurde nach 6 Monaten eine Abnahme der Hornhautdicke von durchschnittlich 740 μm auf durchschnittlich 640 μm beobachtet. Bei den 4 Patienten mit bullöser Keratopathie und diffusem Hornhautödem hingegen nahm die Hornhautdicke nach der Behandlung mit Y-27632 nicht ab [104, 153]. Die zweite Gruppe bestand aus 3 Patienten, die nach einer Kataraktoperation an einer bullösen Keratopathie litten, bei der die Descemet-Membran teilweise abgelöst und verloren war. Diese Patienten wurden direkt mit topischer Gabe von 1 mM Y-27632 6-mal täglich über 4 Monate und mit Augentropfen 4-mal täglich über 2 Monate behandelt [150]. Nach 3 Monaten Behandlung ging das Hornhautödem von Werten von 900–610 μm auf Werte von 580–503 μm zurück. Die Sehschärfe erholte sich bei 2 Patienten auf 20/20 und bei 1 Patienten auf 20/25 [150]. Diese Studien implizieren, dass der Therapieerfolg vom Krankheitsbild abhängt, und unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung einer kontrollierten Dosierung und Behandlungsdauer.

Ripasudil, ein weiterer ROCK-Inhibitor, zeigte ebenfalls Erfolge bei der Reduktion des Hornhautödems und der Wiederherstellung der Hornhauttransparenz in einem Kaninchenmodell der bullösen Keratopathie [156]. Y-27632 und Ripasudil zielen auf die ATP-abhängigen Kinasedomänen von ROCK1 und ROCK2 mit IC50-Werten von 0,11 M und 0,051 M für ROCK1 bzw. 0,17 M und 0,019 M für ROCK2 [83]. Die höhere Wirksamkeit und Affinität für ROCK1 und ROCK2 von Ripasudil im Vergleich zu Y-27632, die sich in den niedrigeren IC50-Werten widerspiegelt, ist auf das Hinzufügen eines Fluoratoms in der Isochinolineinheit zurückzuführen [94, 120]. Beide ROCK-Inhibitoren zeigen eine vergleichbare Verteilung im Auge und erreichen die höchsten Konzentrationen in der Hornhaut 15–30 Minuten nach der Instillation [83, 28]. In-vitro-Studien deuten darauf hin, dass Ripasudil die Zellproliferation, Migration und Adhäsion fördern könnte [198] und somit die Regeneration des Hornhautendothels induziert. Eine erste Studie am Menschen wurde 2016 in Australien durchgeführt. 2 Patienten mit FECD nach DSO/DWEK und unklarer Hornhaut nach 2 und 3 Monaten wurden 2 Wochen lang 6-mal täglich mit Ripasudil-0,4%-Augentropfen behandelt. 1 Monat nach der Behandlung hatten die CECs bei beiden Patienten das kahle Stroma wieder besiedelt, wobei die Hornhauttrübung zurückgegangen war [142]. In der gleichen Studie wurde ein anderes Auge, das 2 Monate nach einer DSO/DWEK-Prozedur noch nicht klar war, 2 Wochen lang mit der topischen Verabreichung von 10 μM Y-27632 als Augentropfen 6-mal täglich ohne Erfolg behandelt.

ROCK-Inhibitoren haben sich in klinischen Studien als erfolgreich erwiesen. Die Zahl der Patienten, die an diesen Studien teilnehmen, ist jedoch sehr gering, auch wenn für eine Reihe von Studien derzeit Patienten rekrutiert werden. Um festzustellen, ob ROCK-Inhibitoren einen positiven Effekt bei der Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen haben, sind größere randomisierte kontrollierte Studien mit einer DWEK-Kontrollgruppe und einer genau definierten Dosierung und Therapiedauer dringend erforderlich.

Zudem muss jeder einzelne Krankheitsfall verstanden werden, damit wir erkennen können, welche Patienten von der Therapie profitieren und welche Patienten keine geeigneten Kandidaten sind. Entscheidende Überlegungen könnten das Alter des Patienten, der genetische Hintergrund, das Stadium der Erkrankung, das Fehlen/Vorhandensein oder die Menge der Bullae, die periphere CEC-Dichte und die Form und Größe der Descemetorhexis sein. Ein Teil dieser Herausforderungen besteht darin, dass die biologische Wirkung von ROCK-Inhibitoren nicht gut verstanden ist, z.B. ob sie das Überleben, die Proliferation oder die Mi­gration von Zellen erhöhen.

Derzeit laufen 4 randomisierte, doppelblinde klinische Studien der Phase II zur topischen Anwendung von Ripasudil bei der Behandlung der FECD. Eine erste Studie in Deutschland (Identifikationsnummer NCT03575130) wird 21 Teilnehmer umfassen und die topische Verabreichung von Ripasudil-0,4%-Augentropfen über einen Zeitraum von 2–4 Wochen 6-mal täglich nach einem DWEK-Eingriff untersuchen. Die Kontrollgruppe unterzieht sich einer DWEK-Operation und erhält eine Placebo-Behandlung mit künstlichen Tränen. Eine zweite klinische Studie in den USA (Identifikationsnummer NCT03813056) wird 72 Teilnehmer umfassen und den Nutzen von Ripasudil-0,4%-Augentropfen untersuchen, die 6-mal täglich über einen Zeitraum von 2–4 Wochen nach einem DMEK-Eingriff verabreicht werden. Die Kontrollgruppe wird mit DMEK behandelt und erhält eine Placebo-Behandlung mit künstlichen Tränen. Eine dritte Studie (Identifikationsnummer NCT03249337) vergleicht das Ripasudil-Dosierungsschema von 3-mal täglich mit 6-mal täglich bei Patienten, die sich einem DSO/DWEK-Verfahren zur FECD unterzogen haben. Schließlich wird in einer vierten internationalen Multicenterstudie (Identifikationsnummer NCT04250207) mit 60 Teilnehmern die topische Anwendung von 2 verschiedenen Dosierungen von Ripasudil-Augentropfen (K-321-Lösung) nach DWEK-Eingriffen bei FECD-Patienten untersucht. Die Hälfte der DWEK-Kontrollgruppe erhält nur ein Placebo, die andere Hälfte 2-mal täglich ein Placebo und 2-mal täglich Ripasudil. Diese Studien werden weitere Erkenntnisse über den Einsatz von ROCK-Inhibitoren zur Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen liefern.

Bislang sind ROCK-Inhibitoren die am besten untersuchten Medikamente zur Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen, aber auch andere pharmakologische Wirkstoffe zur Förderung der Hornhautendothelregeneration werden vielversprechend erforscht. Verschiedene Wachstumsfaktoren wie der epidermale Wachstumsfaktor [74], der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor [75] und der Fibroblastenwachstumsfaktor [125] wurden untersucht, um die Migration und die Proliferation von CECs zur Geweberegeneration zu fördern. Ihr potenzieller Nutzen ist jedoch mit dem Risiko verbunden, eine unerwünschte EndMT zu verursachen [194, 239]. Die Forschung auf diesem Gebiet hat ein gentechnisch verändertes FGF-1-Molekül, TTHX1114 [242], identifiziert, das in vitro und in vivo das Potenzial gezeigt hat, die Regeneration des Hornhautendothels ohne relevante Nebenwirkungen auszulösen (US-Patentregisternummer, US 2016/0263.190 A1). Derzeit läuft in den USA eine klinische Studie der Phase I/II (Identifikationsnummer NCT04520321), in der die Sicherheit und die Wirksamkeit von TTHX1114 zur Behandlung von Hornhautendothelerkrankungen untersucht werden. Diese Studie befindet sich in einer frühen Rekrutierungsphase.

Es gibt auch Forschungsarbeiten, die sich speziell mit der pharmakologischen Modulation der FECD befassen. Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Umgebung der FECD das Risiko eines Übergangs vom Endothel zum Mesenchym erhöht, was zu einem Funktionsverlust des Hornhautendothels führt [102]. Einer der besser verstandenen Faktoren, die diesen Übergang verursachen, ist der Anstieg von TGF-β [194, 239]. TGF-β-Inhibitoren können den Übergang von endothelialen zu mesenchymalen CECs in vitro reduzieren [148], was auf das Potenzial dieser pharmakologischen Wirkstoffe zur Behandlung von Patienten mit FECD hinweist.

Ein weiteres Merkmal des pathologischen Profils der FECD ist der Zelltod durch erhöhten oxidativen Stress [92]. Es konnte gezeigt werden, dass N-Acetylcystein (NAC), ein Fänger reaktiver Sauerstoffspezies, das Absterben von CECs in vitro und im transgenen Mausmodell COL8A2L450W/L450W [64, 97] sowie in einem CEC-UV-Schadensmodell [122] reduziert. Das transgene COL8A2-Modell entwickelt jedoch kein Hornhautödem, und das von Liu et al. [122] entwickelte Tiermodell ist ein Modell für UV-Schäden, nicht für FECD. Auch Sulforaphan wurde als Mittel zur Verringerung von oxidativem Stress identifiziert, da es Nrf2 phosphoryliert und aktiviert, einen Transkriptionsfaktor, der die Expression von antioxidativen Stressproteinen fördert. Es wurde gezeigt, dass es die Apoptose von CEC in vitro reduziert [123, 260]. Auch bei Oxotremorin, einem selektiven muskarinischen Acetylcholinrezeptor-Agonisten, und Mefenaminsäure, einem nichtsteroidalen Antiphlogistikum, wurde gezeigt, dass sie oxidativen Stress reduzieren und die Überlebensrate menschlicher CECs in vitro erhöhen [98]. Diese Daten deuten darauf hin, dass pharmakologische Wirkstoffe als mögliche Behandlung für die FECD eingesetzt werden könnten. Es besteht jedoch ein eindeutiger Bedarf an doppelblinden, randomisierten, kontrollierten klinischen Studien, um aussagekräftigere Ergebnisse zu erhalten.

Fortschritte bei den Protokollen für die Expansion primärer humaner CECs und ihre Verabreichung in vivo stellen das derzeitige Paradigma «ein Spender – ein Patient» infrage. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Forschung Protokolle entwickeln wird, um ältere Spenderhornhäute erfolgreich zu kultivieren, aber auch um die Anzahl der CECs zu erhöhen, die von einem einzigen Spender gewonnen werden können. Darüber hinaus könnte die künftige Forschung zur Gewinnung von CECs aus pluripotenten Stammzellen eine neue Quelle von Zellen für die Therapie erschließen und damit den Bedarf an allogenen Spendern umgehen. Eine aktuelle klinische Studie in Japan, bei der iPSC-abgeleitete Hornhautepithelzellen zur Behandlung von Patienten mit Limbusstammzellinsuffizienz eingesetzt werden (UMIN000036539), könnte den Grundstein für zukünftige Therapien auf Basis pluripotenter Stammzellen zur Behandlung von Hornhauterkrankungen legen.

Zukünftige Ergebnisse der laufenden klinischen CEC-Studien in Japan und Singapur werden ein besseres Verständnis der Durchführbarkeit von CEC-Verabreichungsmethoden ermöglichen. Es ist durchaus möglich, dass die Menge der für die Zellinjektion verwendeten CECs im Vergleich zu den derzeit verwendeten Millionen Zellen pro Auge reduziert werden kann, wodurch die Zahl der Patienten, die mit Gewebe von einem einzigen Spender behandelt werden können, erhöht wird. Zudem werden die laufenden klinischen Studien dazu beitragen, klinische Endpunkte für CEC-Therapien zu definieren, die für Therapien der regenerativen Medizin von großer Bedeutung sind, da sie einen integralen Bestandteil der behördlichen Zulassung darstellen [197]. Schließlich würden synthetische CEC-Träger eine kostengünstigere, unbegrenzte und standardisierte Alternative bieten.

Azelluläre Hornhautendotheltransplantate stellen einen alternativen therapeutischen Ansatz dar, der wesentlich kostengünstiger ist und vor allem in Entwicklungsländern von Nutzen sein wird. Zukünftige klinische Studien werden zeigen, wie lange die Hornhaut mit solchen Mitteln transparent gehalten werden kann.

Die lamelläre Hornhauttransplantation ist derzeit das Standardverfahren zur Behandlung endothelialer Hornhauterkrankungen. Da immer mehr therapeutische Möglichkeiten zur Verfügung stehen, ist es entscheidend, für jeden Patienten die jeweils beste Behandlungsmöglichkeit auszuwählen. In den kommenden Jahren wird die Forschung ein besseres Verständnis darüber ermöglichen, welche Spektren von Hornhautendothelerkrankungen mit den einzelnen Ansätzen erfolgreich behandelt werden können. Möglicherweise sind junge Patienten mit langen CTG-Wiederholungen im TCF4-Gen und früher bis mittelschwerer FECD Kandidaten für eine genetische Modulation. Andererseits können FECD-Patienten mit gutem peripherem Hornhautendothel mit ROCK-Inhibitoren allein oder in Kombination mit DSO/DWEK behandelt werden. Die schwere bullöse Keratopathie und die fortgeschrittene FECD können durch lamelläre Keratoplastik oder Zelltherapie behandelt werden, die bei bullöser Keratopathie durch Injektion und bei FECD durch Träger verabreicht werden. Der Ansatz der personalisierten Medizin wird mehr Menschen den Zugang zu Therapien ermöglichen und die Auswirkungen des weltweiten Spendermangels mildern.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben, die einen Einfluss auf die vorgelegte Arbeit haben könnten.

Anteil der einzelnen Autoren: P.C. (15%), G.T. (7%), H.S. (7%), J.S.M. (7%), M.P. (7%), S.N.D. (7%), R.W.J.C. (7%), R.M.M.A.N. (7%), S.F. (10%), V.L.S.L. (13%) und M.M.D. (13%).

Konzeptualisierung: P.C., S.F., V.L.S.L. und M.M.D.; Recherche: P.C.; Schrei­ben – Erstellung des ursprünglichen Entwurfs: P.C.; Überarbeitung und Redaktion: G.T., H.S., J.S.M., M.P., S.N.D., R.W.J.C., R.M.M.A.N., S.F., V.L.S.L. und M.M.D.; Supervision: V.L.S.L. und M.M.D.; Beschaffung von Finanzmitteln: R.M.M.A.N., V.L.S.L. und M.M.D.

P.C., R.M.M.N, V.L.S.L. und M.M.D. wurden für diese Arbeit von Chemelot InSciTe im Rahmen des EyeSciTe-Konsortiums finanziert.

Die Autoren danken Dr. Kerstin Wickstrom (Icelandic Medicines Agency) für das wertvolle Feedback zum Abschnitt «Ansätze für einen Rechtsrahmen für die regenerative Medizin für das Hornhautendothel in der Europäischen Union: vom Labor zum Krankenbett».

Català P, Thuret G, Skottman H, Mehta JS, Parekh M, Ní Dhubhghaill S, Collin RWJ, Nuijts RMMA, Ferrari S, LaPointe VLS, Dickman MM: Approaches for corneal endothelium regenerative medicine. Prog Retin Eye Res. 2022;87:100987. (DOI: 10.1016/j.preteyeres.2021.100987). © 2021 The Authors. (Übersetzung, gekürzte Version; Abbildungen 1, 7, 10 und 11, Tabelle 1 und 2, Kapitel 7, 8 und 9 gekürzt, Nummerierung der Abbildungen angepasst), lizensiert unter CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.de). Gekürztes Material abrufbar unter https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2021.100987.

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