Whole-Genome-Sequenzierung von Schleimhautmelanomen zeigt diverse Treiber und therapeutische Targets auf Free

Schleimhautmelanome entstehen aus Melanozyten, welche in verschiedenen innenliegenden epithelialen Geweben ektodermalen Ursprungs vorkommen. Mundhöhle, Nase und Nasennebenhöhlen sowie Genitaltrakt und Anorektalregion sind die häufigsten Primärlokalisationen von Schleimhautmelanomen. In Populationen, in denen Hautmelanome weit verbreitet sind, insbesondere bei denen europäischer Abstammung, machen Schleimhautmelanome weniger als 1 % aller Melanome aus, doch in anderen Populationen kann ihr Anteil an der Gesamtheit der Melanome bis zu 25 % betragen [1]. Warum sie entstehen, ist nicht bekannt; aktuelle genomische Studien sprechen dafür, dass ultraviolette Sonnenstrahlung (UVR) nicht das hauptsächlich verantwortliche Karzinogen ist. Studien, in denen Exome [2-6] oder ganze Genome sequenziert wurden [2, 7], haben ergeben, dass Schleimhautmelanome im Vergleich zu Hautmelanomen eine erheblich geringere Punktmutationslast und dafür höhere Last struktureller chromosomaler Varianten aufweisen und dass diese Mutationen praktisch keine Signaturen von UVR oder anderen bekannten Karzinogenen zeigen. In dieser Hinsicht gleichen sie akralen Melanomen, die an den volaren Flächen der Hände, Füße, Finger und Zehen auftreten und deren Ätiologie ebenfalls ungeklärt ist. Schleimhautmelanome sind schwierig zu behandeln. Im Gegensatz zu Hautmelanomen werden sie typischerweise erst in einem fortgeschritteneren Stadium entdeckt, haben keine dominanten MAP-Kinase-aktivierenden Mutationen und sprechen seltener auf Immuntherapien an [8, 9]. Die Suche nach klinisch handlungsrelevanten Treibermutationen ist bei dieser Tumorart bisher begrenzt erfolgreich. Veränderungen der Gene SF3B1, KIT und NF1 sind – verglichen mit Hautmelanomen – relativ häufig [7], während BRAF- und NRAS-Mutationen bei Schleimhautmelanomen weniger häufig sind [3, 4, 10]. Ähnlich wie bei einigen Hautmelanomen können auch bei Schleimhautmelanomen BRAF-Fusionen auftreten, allerdings kommt dies selten vor. Tumoren mit solchen Fusionen zeigen ein gewisses Maß an Sensitivität für eine zielgerichtete Anti-MEK-Therapie, doch eine langfristige Krankheitskontrolle wird damit selten erreicht [11]. Da die biologischen Grundlagen des Schleimhautmelanoms weiterhin nicht vollständig geklärt sind und dies sowohl der Prävention als auch der Therapie Grenzen setzt, haben wir die bisher größte genomische Analyse von Schleimhautmelanomen (n = 112) aus China, Australien, den USA und Europa durchgeführt. Mittels Whole Genome Sequencing (WGS) analysierten wir 67 frisch eingefrorene Tumorgewebeproben und validierten die wichtigsten Treibergene in Daten aus dem Whole Exome Sequencing (WES). Wir identifizierten dabei mehrere Treiber, die darauf hindeuten, dass der Großteil der Schleimhautmelanome potenziell empfindlich gegenüber CDK4/6- und/oder MEK-Inhibitoren ist.

67 Patienten mit frisch eingefrorenen Tumorgewebeproben wurden in die WGS-Analyse einbezogen und 45 Patienten mit FFPE-Tumoren in die Validierungskohorte. Demografische Eckdaten, Herkunftsländer und klinisch-pathologische Merkmale der 67 Patienten und ihrer Tumoren, die der WGS unterzogen wurden, sind in online Datensupplement 1 (vollständiges online Supplemental Material siehe unter www.karger.com/doi/10.1159/000509960) dargestellt. Die Proben stammten von 12 Schleimhautmelanomen aus der Anorektalregion, 15 aus dem weiblichen Genitaltrakt, 17 aus dem Mundraum, 17 aus der Nase, 2 aus der Konjunktiva; bei weiteren 4 Schleimhautmelanomen war die Primärlokalisation unbekannt. Die Proben wurden in China (n = 39), Australien (n = 24), Schweden (n = 3) und der Schweiz (n = 1) entnommen. Die Proben aus China stammten vorwiegend aus Lokalisationen der oberen Körperhälfte (31/39), die aus Australien und Europa vorwiegend aus der unteren Körperhälfte (20/28). Die Proben waren teils von Primärtumoren (n = 31), teils von Rezidiven oder Metastasen (n = 26); für 10 Proben lag diese Information nicht vor. Überlebens- und Behandlungsdaten sind ebenfalls in online Datensupplement 1 enthalten, allerdings wurde aufgrund der kurzen Nachbeobachtungszeiten bei den Proben aus China (alle unter 2 Jahren; Median: 4,4 Monate) keine formale Analyse der Assoziation zwischen dem Überleben und genomischen Merkmalen durchgeführt.

Die Proben wurden einem WGS mit einer durchschnittlichen Sequenziertiefe von 55× (Bereich: 42–100×) in der Tumorprobe und 31× (Bereich: 21–55×) in der parallelisierten normalen Kontroll-DNA unterzogen. Die ethnische Abstammung der Patienten wurde mittels Hauptkomponentenanalyse untersucht, um die Genotypen der WGS-Proben mit 1000G-Phase-3-Proben bekannter Populationen zu vergleichen (online Supplement, Abb. 1). Alle Proben aus China und eine aus Australien (n = 40) ergaben Cluster in Übereinstimmung mit der Superpopulation ostasiatischer Abstammung. 24 Proben ergaben Cluster in Übereinstimmung mit einer europäischen Abstammung, 3 weitere Proben aus Australien gingen weder auf europäische noch auf asiatische Abstammung zurück. Die genetische Abstammung wurde im Rahmen der Studie zu nachfolgenden Vergleichen der Proben im Hinblick auf genomische Merkmale herangezogen. Nach der genetischen Abstammung betrachtet war das Alter bei der Erstdiagnose des Schleimhautmelanoms bei Patienten ostasiatischer Abstammung niedriger als bei denen europäischer Abstammung (Mann–Whitney; p = 0,01; mittleres Alter: 53 vs. 63 Jahre).

Die Validierungskohorte beruhte auf FFPE-Schleimhauttumoren aus Großbritannien und den USA; hiervon waren 4 aus der Anorektalregion entnommen, 21 aus dem weiblichen Genitaltrakt, 3 aus dem Mundraum und 17 aus der Nase. Sie wurden einem WES in einer durchschnittlichen Sequenziertiefe von 75× (Bereich: 25–106×) im Fall der Tumorproben bzw. 88× (Bereich: 48–115×) im Fall der parallelisierten normalen Kontrollproben unterzogen (online Datensupplement 2).

Übereinstimmend mit unserem früheren Bericht zu diesem Tumortyp [7] zeigten alle Schleimhautmelanome eine geringe Mutationslast an Einzelnukleotidvarianten (SNV; single-nucleotide variants) und Insertionen/Deletionen (indel) von durchschnittlich 2,7 Mutationen pro Mb (Bereich: 0,54–7,1) (Abb 1a). Bei Tumoren aus oralen, konjunktivalen und nasalen Lokalisationen waren diese Raten etwas höher als bei Tumoren aus dem Anorektal- oder Urogenitalbereich (Mann–Whitney; p = 0,08). Proben aus Primärtumoren wiesen eine signifikant geringere Mutationslast auf als Proben aus Rezidiven und Metastasen (Mann-Whitney; p = 0,033).

Bei der Betrachtung des benachbarten Nukleotidkontexts dieser Mutationen wurden sieben Mutationssignaturen mit Substitution einzelner Basenpaare identifiziert (Abb 1b; online Supplement, Abb. 2a). Im Gegensatz zu Hautmelanomen, in denen typischerweise (70–95 %; online Supplement, Abb. 2b) die UVR-assoziierte COSMIC-Signatur 7 vorherrschend ist [7], zeigten die meisten Schleimhauttumoren keine oder geringe Anteile von Signatur 7. Interessant ist hierbei jedoch, dass neben einem Bindehautmelanom, in dem der Anteil der UVR-Signaturen erwartungsgemäß hoch war, dieser Anteil auch bei fünf weiteren Tumoren >50 % betrug (online Supplement, Abb. 2b). Alle diese Tumoren stammten von Schleimhautlokalisationen der oberen Körperhälfte (und aus China), mit Ausnahme einem Tumor unbekannter Primärlokalisation (Abb 1a, c). Zwischen den Proben mit >50 % und denen mit <50 % UVR-Signaturen bestanden keine signifikanten Unterschiede bei der Anzahl der SNV/indels, Strukturvarianten oder beim Anteil des von Abweichungen der Kopienanzahl betroffenen Genoms.

Der Anteil der ubiquitären altersassoziierten Signatur 1 war höher in Schleimhautlokalisationen der oberen als der unteren Körperhälfte (Mann-Whitney; p < 0,0001), wobei es keinen signifikanten Altersunterschied zwischen den Patienten mit Tumoren der oberen und der unteren Körperhälfte gab (Mann-Whitney; p = 0,22) (Abb 1c). Allerdings stammten die in dieser Studie untersuchten Tumoren der unteren Körperhälfte vorwiegend von europäischen Patienten, und es bestand ein signifikanter Unterschied beim Alter bei der Diagnosestellung zwischen den Patienten europäischer und denen asiatischer Abstammung (Mann-Whitney, mittleres Alter 63 vs. 53 Jahre, p = 0,01). Bei drei Signaturen wurde starke Ähnlichkeit mit zuvor identifizierten Signaturen festgestellt (gemäß Kosinus-Ähnlichkeit): ubiquitäre Signatur 5, Signatur 17 sowie eine ähnliche Signatur wie Signatur 3, welche wir kurz Signatur-3-ähnlich tauften (online Supplement, Abb. 2a) und die eine Zusammensetzung aus den Signaturen 3, 39 und 40 darstellt. Signatur 3 ist mit BRCA1-, BRCA2- und/oder PALB2-Mutationen in Verbindung gebracht worden [12-14]. In den Tumorproben mit >50 % Anteil der Signatur-3-ähnlichen Signatur wurden jedoch keine pathogenen Keimbahnvarianten oder biallelen Verluste somatischer Mutationen in BRCA1, BRCA2 oder PALB2 festgestellt. Diese Signatur im Schleimhautmelanom könnte daher auf den Beitrag der Signaturen 39 und 40 zurückzuführen sein, deren Ätiologie nicht bekannt ist. Signatur 17, ebenfalls von unbekannter Ätiologie, lag ausschließlich in Proben von Patienten chinesischer Abstammung (n = 6) und vorwiegend in Proben aus der oberen Körperhälfte vor.

Die letzten beiden Mutationssignaturen wurden kürzlich im Rahmen des PCAWG-Projekts (Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes) beschrieben [15]. Es handelt sich hierbei um Signatur 38, die nahezu ausschließlich in Melanomen vorkommt und für die ein indirekter UVR-Effekt als Ursache diskutiert wird, sowie Signatur 31, die nur in einem der Schleimhautmelanome dominant war. Signatur 31 (und die damit eng verwandte Signatur 35) sind mit der Behandlung mit Cisplatin in Zusammenhang gebracht worden [16]; bei dem Patienten mit der dominanten Signatur 31 im Melanom wurde nachfolgend bestätigt, dass er vor der Biopsie mehrere Zyklen Cisplatin-Chemotherapie erhalten hatte. Übereinstimmend mit früheren Beobachtungen zeigte Signatur 31 einen Strang-Bias in entgegengesetzter Richtung wie die UVR-assoziierte Signatur 7 und wies einen hohen Anteil Dinukleotid-Substitutionen CT > AC auf. Signatur 7 hingegen zeigte die typischen durch UVR hervorgerufenen Dinukleotid-Substitutionen CC > TT (online Supplement, Abb. 2c, d).

Die Tumoren wiesen im Mittel je 260 Strukturvarianten (SV) auf (Bereich: 21–1.300). Bei der Klassifizierung als Rearrangement-Signaturen nach räumlicher Verteilung der SV und Zusammensetzung der Fragmentgrößen [17] wurden fünf Rearrangement-Signaturen identifiziert (Abb 2a) und anhand der Kosinus-Ähnlichkeit mit zuvor beschriebenen Rearrangement-Signaturen [17] verglichen. Alle Signaturen hatten eine Ähnlichkeit von >0,8 und wurden als RS4 (Ähnlichkeit: 0,99), RS6 (0,97), RS2 (0,98), RS1 (0,85) und RS5 (0,86) identifiziert. RS4 und RS6 sind durch Cluster von SV-Bruchpunkten gekennzeichnet, wobei RS4 eine hohe Anzahl interchromosomaler Translokationen und RS6 Cluster von Inversionen, Duplikationen und Deletionen aufweist. Unüberwachtes hierarchisches Clustering gemäß den Anteilen der Rearrangement-Signaturen identifizierte zwei Gruppen von Tumoren (Abb 2b). 28 Tumoren waren charakterisiert durch insgesamt hohe SV-Zahlen, Bruchpunkt-Cluster, Dominanz der Signaturen RS4 und RS6 sowie eine hohe Anzahl Kataegis-Genloci (lokal begrenzte Abschnitte mit Substitutions-Hypermutation) (Gruppe 1). Die restlichen 39 Tumoren hatten niedrigere SV-Zahlen, mit dominanten nicht-geclusterten SV-Signaturen RS1, RS2 und RS5 sowie wenigen Kataegis-Loci (Gruppe 2) (Abb 2a). Die relativen Anteile der Tumoren in Gruppe 1 und Gruppe 2 unterschieden sich weder nach oberer oder unterer Körperhälfte (Fisher Exact; p = 0,45) noch nach genetischer Abstammung der Probe (Fisher Exact; p = 0,24).

Komplexe Ereignisse betrafen häufig die Chromosomen 5, 11 und 12 und kamen primär in Proben aus Gruppe 1 vor (Abb 2b). Eine Untersuchung der Chromosomen, die Anzeichen von Bruchpunkt-Clustern aufwiesen, ergab, dass die lokalisierten Ereignisse einige Merkmale genomischer Katastrophen aufwiesen. Zwar zeigten einige Tumoren Muster, die einer Chromothripsis (Bruchpunkt-Cluster, schwankende Kopienzahl, Erhalt der Heterozygotie) und dem BFB-Muster (breakage-fusion-bridge; Verlust von Telomerregionen und hohe Anzahl Inversionen) ähnelten, doch die meisten Ereignisse waren zu komplex, um sie mit Bestimmtheit einem einzigen konkreten Mutationsmechanismus zuzuordnen. Weitere komplexe fokale Ereignisse betrafen amplifizierte Genloci, die durch zahlreiche Translokationen verknüpft waren. Fokale Regionen auf Chromosom 5p (online Supplement, Abb. 3a), 11q (online Supplement, Abb. 3b) und 12q (online Supplement, Abb. 3c) waren in besonderem Maße betroffen und wiesen eine hohe Dichte an SV-Bruchpunkten auf, und in rund 20 % der Tumoren enthielten die Regionen auch stark amplifizierte Loci. Diese amplifizierten Loci umfassten die bekannten Melanom-Treiber TERT (chr5), CCND1 (chr11), MDM2 (chr12) und CDK4 (chr12) [7, 18] (online Supplement, Abb. 3d–f) sowie weitere Gene, über deren Amplifikation und/oder Überexpression in Melanomen bereits berichtet wurde [19, 20], darunter SKP2 (chr5) und GAB2 (chr11). Beispiele für stark betroffene Regionen in einzelnen Proben sind in online Supplement, Abb. 4a–c dargestellt. Besonders bemerkenswert sind hierbei acht Proben mit multiplen (>5 pro Probe) Translokationsereignissen zwischen 5p und 12q (online Supplement, Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass diese wiederkehrenden Ereignisse positiv selektiert werden. Die Proben mit Chromosom-5p-12q-Translokationen waren mehrheitlich Melanome der Mundschleimhaut (7 oral, 1 anorektal), hatten Amplifikationen von CDK4 oder MDM2 (7/8) auf Chromosom 12 und von TERT oder SKP2 (4/8) auf Chromosom 5 und stammten von Patienten ostasiatischer Abstimmung (7 ostasiatisch, 1 europäisch) mit niedrigerem Alter bei der Tumordiagnose im Vergleich zur Gesamtkohorte (p = 0,006; mittleres Alter 42 vs. 58 Jahre). Bei Betrachtung nur der Mundschleimhautproben kamen diejenigen mit chr5p–12q-Translokationen von Patienten mit niedrigerem Alter bei der Diagnose (Mann–Whitney; p = 0,008, mittleres Alter 39 vs. 58 Jahre bei gemeinsamer Betrachtung aller Abstammungen; p = 0,01 bei Betrachtung nur der Patienten mit ostasiatischer Abstammung); bezogen auf das Geschlecht des Patienten gab es hingegen keinen Unterschied.

Fokale Regionen struktureller Rearrangements auf Chromosomen wie 5p, 12p und 11p waren außerdem co-lokalisiert mit Regionen lokalisierter Hypermutation, welche auch als Kataegis bezeichnet werden [21]. Der Trinukleotid-Kontext von SNV innerhalb der Kataegis-Loci zeigte Merkmale der Mutationssignaturen 2 und 13, welche mit APOBEC-Desaminierung assoziiert sind (online Supplement, Abb. 3g). APOBEC-Signaturen waren in der Mutationssignaturanalyse der Gesamtkohorte (Abb 1) nicht identifiziert worden; dies liegt jedoch wahrscheinlich an der geringen Zahl der SNV in den Kataegis-Loci, bezogen auf die Gesamtheit der SNV (0,6 %).

Im online Datensupplement 3 sind alle codierenden SNV/indels in den mittels WGS analysierten Schleimhautmelanomen aufgeführt. Wir verwendeten zur Identifizierung der signifikant mutierten Gene (SMG) einen Konsens-Ansatz mit fünf Tools: Oncodrive Suite (mit OncodriveFM und OncodriveFML), MuSiC2, 20/20+, dNdScv und MutSigCV. Insgesamt 10 Gene wurden als signifikant mutiert eingestuft: NRAS (12/67), BRAF (11/67), NF1 (11/67), KIT (10/67), SF3B1 (8/67), TP53 (6/67), SPRED1 (5/67), ATRX (4/67), HLA-A (4/67) und CHD8 (3/67) (Abb 3a; online Supplement, Abb. 5 und Daten 4). Die BRAF-Mutationen waren sehr heterogen (Abb 3b), jedoch befanden sich alle in der Protein-Tyrosinkinase-Domäne, und die meisten betrafen die Hotspot-Region der Aminosäuren 594–600. Die NRAS-Mutationen befanden sich schwerpunktmäßig in Hotspots in Codon 61, dem dominanten Hotspot bei Hautmelanomen, und Codon 12, das beim Hautmelanom seltener als Mutations-Hotspot betroffen ist [7, 18, 22, 23] (Abb 3b). Verschiedene Mutationen, die den MAP-Kinase-Signalweg aktivieren, schlossen sich nahezu durchgängig gegenseitig aus, wie bereits an anderer Stelle berichtet wurde [7, 18, 23]. NRAS-Mutationen wurden mehrheitlich in Proben aus Rezidiv-/Metastasenlokalisationen gefunden (zwei primär, acht Rezidiv/Metastase, zwei unbekannt; Fisher Exact, p = 0,032). Interessanterweise gab es wenig Überschneidung zwischen Tumoren mit Mutationen im MAP-Kinase-Signalweg und in SF3B1, was darauf hindeutet, dass die letztere Mutation zur MAP-Kinase-Aktivierung führen könnte. Alle SF3B1-Mutationen lagen im Codon-625-Hotspot (Abb 3b), und alle SF3B1-mutierten Tumoren außer einem stammten aus dem Anorektal- oder weiblichen Genitalbereich. SF3B1-Mutationen kamen außerdem vorwiegend in Schleimhautmelanomen von Patienten europäischer Abstammung (7/8) und ausschließlich in Proben von Primärtumoren vor. BRAF-Mutationen waren bei Tumoren aus der Nasenhöhle selten; es wurde keine Codon-600-Mutation und nur eine G-Loop-Mutation identifiziert (G469A). Die sechs Tumoren mit >50 % UV-Signatur zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Mutationen der Treibergene, es fehlten jedoch Mutationen in TP53, SPRED1 und SF3B1. Weitere Zusammenhänge zwischen SMG und der anatomischen Lage des Primärtumors, dem Status Primärtumor vs. Metastase/Rezidiv oder der Abstammung des Patienten waren nicht zu erkennen.

Die SMG in einem Validierungs-Set von FFPE-Tumoren wurden mittels WES-Analyse untersucht (Abb 3c; online Supplement, Abb. 5). Die Gene HLA-A und CHD8 waren in diesem Set nicht mutiert und sind somit potenziell falsch-positive SMG, doch die anderen Gene zeigten Mutationen in vergleichbarer Häufigkeit wie im Discovery-Set, mit Ausnahme von BRAF und SPRED1, die jeweils nur bei 1/45 der WES-Tumoren mutiert waren. Auch hier lagen SF3B1-Mutationen prädominant (5/6) in Tumoren der Anogenitalregion vor.

Da SMG-Algorithmen keine Promoter-Mutationen berücksichtigen, gehen wir auf TERT-Promoter-Mutationen weiter unten im Kontext anderer Telomer-erhaltender Gene und Mutationsmechanismen ein.

Wir suchten nach somatischen Mutationen in anderen bekannten Treibergenen, die entweder beim Melanom oder bei anderen Krebsarten beschrieben worden waren. Vier WGS-Proben trugen somatische Mutationen im Gen CTNNB1 (online Datensupplement 3). Zwei der Proben kamen aus Australien (ein anorektales Melanom mit p.L31_I35del und ein Schleimhautmelanom mit Ursprung im Tränensack mit p.S33C), die anderen beiden waren aus China (ein nasales Melanom mit p.T41A und ein orales Melanom mit p.P44A und p.S45P im selben Haplotyp). Zwei Proben aus der WES-Validierungskohorte hatten ebenfalls CTNNB1-Mutationen. Alle diese Mutationen traten an für verschiedene Krebsarten dokumentierten Hotspots auf [24]. Bei einzelnen WGS-Proben bemerkten wir außerdem aktivierende Hotspot-Mutationen in den Onkogenen MAP2K1, GNAQ und KRAS sowie eindeutig zum Funktionsverlust (LoF; loss of function) führende Mutationen in den Tumorsuppressorgenen CDKN2A (Nonsense), BAP1 (Rasterverschiebung), MEN1 (Nonsense) und NF2 (Rasterverschiebung).

Im nächsten Schritt identifizierten wir Gene mit signifikanten Kopienzahl-Variationen (CNV) laut GISTIC, Gene, die immer wieder von SV-Bruchpunkten betroffen sind und im COSMIC Cancer Gene Census erfasst sind, Gene, die in dieser Studie in der SMG-Analyse ermittelt wurden, sowie Gene, die zuvor als Treibergene beim Melanom identifiziert wurden (Abb 4; online Supplement, Abb. 6). Diese Analyse ergab große Ähnlichkeit mit Hautmelanomen (einschließlich akraler Lokalisationen); besonders häufig waren TERT, CCND1, KIT, MITF, CCND1, MDM2, CDK4 und NOTCH2 durch Amplifikationsverlust betroffen (Abb 4c, d) und NF1, PTEN, CDKN2A, ATM und ARID1B (Abb 4c, e) durch Kopienzahlverlust. Häufig waren CDK4 und MDM2 auf Chromosom 12 gleichzeitig amplifiziert, durch querverbindende Translokationen oft noch gemeinsam mit TERT auf Chromosom 5. Bei zwei Tumoren stellten wir die homozygote Deletion von SPRED1 fest (Abb 4e). Das einzige Gen, bei dem CNV-Aberrationen mit der Abstammung assoziiert war, war NOTCH2; 4 der 6 Fälle von Amplifikationen lagen in Tumoren europäischer Patienten vor.

SV-Bruchpunkte wurden außerdem in SPRED1 festgestellt, und die Melanom-Gene CDKN2A, NF1 und PTEN wiesen häufig Bruchpunkte auf. Die SV resultierten in 391 prognostizierten Fusionsereignissen, an denen 657 Gene beteiligt waren (online Datensupplement 5); jedoch kamen die betroffenen Genpaare jeweils nicht in mehr als einer Probe vor. Zwei Gene (FAM19A2 und TENM4) waren an vier Fusionspaaren beteiligt, und vier Gene (SHANK2, KHDRBS2, PTPRR und RGL1) waren an drei Fusionspaaren beteiligt. Nur von FAM19A2 wurde die gleiche Proteinregion in zwei Proben gefunden, doch in beiden lagen auch multiple prognostizierte LoF-SV im Gen vor. Da FAM19A2 in derselben Chromosomenregion liegt wie MDM2/CDK4, sind dies möglicherweise „Passenger“-Ereignisse ohne funktionelle Bedeutung. Neben einer GRM3-Fusion in einem Schleimhautmelanom, über die wir zuvor berichteten [7], beobachteten wir einzelne Genfusionsereignisse in BRAF, PAK1 und DGKB, die sich mit unseren Beobachtungen beim Hautmelanom decken [7, 25].

Im Vergleich der relativen Telomerlänge (TL) in den Tumoren mit der TL in parallelisierten normalen Kontrollproben zeigten 56 % der Schleimhautmelanome eine TL-Verkürzung. Wir setzten die TL in Beziehung zur primären Tumorlokalisation und Mutationen in wichtigen Genen für die Telomerbiologie [26] (Abb 5). Mutmaßlich aktivierende TERT-Mutationen wurden in einem Drittel der Tumoren gefunden (6/67 Promoter-SNV, 15/67 durch hochgradige Kopienzahlerhöhung einschließlich 1/67 mit sowohl Promoter-SNV als auch hochgradiger Kopienzahlerhöhung); sie waren in der Regel mit einer geringeren TL assoziiert (Mann-Whitney; p = 0,0079) (Abb 5; online Supplement, Abb. 7a). ATRX-Mutationen kamen hingegen seltener vor (4/67 inaktivierende SNV und 3/67 SV; 1/67 mit sowohl SNV als auch SV) und waren mit einer größeren TL assoziiert (p = 0,0025; online Supplement Abb. 7b). Proben mit TP53-SNV/indel-Mutationen zeigten einen Trend zur Telomerverlängerung (p = 0,12; online Supplement Abb. 7c), und bei Miteinbeziehung von Kopienzahlverlust (Kopienzahl 1) und kopienzahlneutralem LoH war eine schwache Assoziation mit einer Telomerverlängerung festzustellen (Mann-Whitney; p = 0,0495; online Supplement, Abb. 7d), wie zuvor berichtet [26]. Bei anderen TL-assoziierten Genen, über die zuvor berichtet wurde (DAXX, RB1, VHL, PBRM1, NRAS), bestand keine Assoziation (online Supplement, Abb. 7e). Aktivierende TERT- und zum Funktionsverlust führende ATRX-Mutationen schlossen sich gegenseitig aus, wie auch bereits bei Gliomen festgestellt wurde [27]. In 4/6 ATRX-mutierten Proben lagen auch SNV-Mutationen von TP53 vor. Ebenso waren in der WES-Kohorte alle drei LoF-ATRX-Mutationen von TP53-Mutationen begleitet. Beim Abgleich der TL mit in dieser Studie identifizierten mutmaßlichen Schleimhauttumor-Treibergenen wurde eine starke Korrelation zwischen KIT-aktivierenden Mutationen und Telomerverkürzung festgestellt (p = 0,0018; online Supplement Abb. 7f). Tumoren der unteren Körperhälfte (p = 0,0022) (online Supplement, Abb. 7g, h) und von Patienten europäischer Abstammung (Mann-Whitney; p = 0,013) waren ebenfalls mit einer geringeren TL assoziiert.

Die Schleimhautmelanome trugen im Mittel vier (Bereich: 0–15) etablierte oder putative Treiber-Genaberrationen (aller Art) (Abb 6a, online Datensupplement 6). Insgesamt hatten alle Tumoren außer einem (66/67) mindestens eine umfassend etablierte Treibergenmutation (Abb 6a), nämlich im MAP-Kinase-Signalweg (NF1, NRAS, KIT, BRAF), SF3B1, TP53 und MDM2, SPRED1, TERT und ATRX, CDK4 und CCND1 (Abb 6b). Im Vergleich der Mutationsprofile der Schleimhautmelanome von Patienten ostasiatischer und europäischer Abstammung bestanden keine Unterschiede in der Häufigkeit von Treibermutationen in einzelnen Genen, mit Ausnahme von SF3B1, das bei Patienten europäischer Abstammung prädominant betroffen war (Fisher Exact; p = 0,011). Bei Betrachtung aller Aberrationen unter dem Aspekt, ob es sich um einen Primärtumor oder ein Rezidiv/eine Metastase handelte, waren Mutationen von SF3B1 (Fisher Exact; p = 0,0057) und SPRED1 (Fisher Exact, p = 0,02) vor allem in Proben aus Primärtumoren vorhanden und NRAS-Aberrationen in Proben aus Rezidiven/Metastasen.

Klinisch handlungsrelevante Mutationen wurden identifiziert, indem mithilfe der Website „Cancer Genome Interpreter“ Mutationen in der jeweiligen Probe gekennzeichnet wurden, von denen prognostiziert wird, dass sie zum Ansprechen auf (Abb 6c) bzw. zur Resistenz gegen (Abb 6d) eine zielgerichtete Therapie führen. Die Inhibitoren mit dem höchsten Evidenzgrad betrafen drei Patienten mit BRAF-V600E, für welche die FDA-Leitlinie den Einsatz von BRAF- und/oder MEK-Inhibitoren vorschlagen, sowie sieben Patienten mit KIT-Mutationen. Insbesondere trug ein großer Teil der Kohorte (47/67, 70 %) Mutationen mit potenziellem Ansprechen auf CDK4/6-Inhibitoren, wobei die Evidenz für diesen Therapieansatz mit Fallberichten und frühen Studienergebnissen auf den unteren Stufen der Verlässlichkeit angesiedelt ist. Zu den Treibermutationen, die als empfindlich für CDK4/6-Inhibitoren identifiziert wurden, zählen CDK4- und CCND1-Amplifikationen sowie CDKN2A-Deletionen. Darüber hinaus hatten, wenngleich dies nicht als signifikant mutierter Treiber identifiziert wurde, mehrere Proben (9/67, 13 %) auch CDK6-Amplifikationen, was auf eine potenzielle Empfindlichkeit gegenüber CDK4/6-Inhibitoren hindeutet. Die Analyse ergab außerdem eine MITF-Amplifikation, eine NF1-Mutation und eine Mutation in MAP2K1 (welches für MEK1 codiert), die Resistenz gegen MEK/MAPK-Inhibitoren verleihen könnten.

In dieser größten bisher durchgeführten Analyse von Schleimhautmelanomen wird High-Coverage-WGS eingesetzt, um Melanome aus verschiedenen Körperregionen von Patientenpopulationen europäischer und asiatischer Abstammung zu vergleichen. Wir zeigen, dass in Schleimhautmelanomen aus dem Gesichtsbereich andere Mutationssignaturen (auf der Grundlage UVR-assoziierter und endogener Mutationsprozesse) vorliegen als in Schleimhautmelanomen der unteren Körperhälfte und dass die Signaturen 7 und 17 bei Patienten asiatischer Abstammung überdurchschnittlich häufig auftreten. Darüber hinaus variiert die Häufigkeit einzelner Treibermutationen je nach Primärlokalisation des Melanoms. So kommen zum Beispiel SF3B1-Hotspot-Mutationen in Melanomen anorektalen und vulvovaginalen Ursprungs häufig vor, in Schleimhautmelanomen anderer Lokalisation hingegen selten [3, 28], und BRAF-Mutationen sind bei Melanomen der Nasenhöhle weniger häufig als bei anderen Lokalisationen. Umgekehrt lassen sich zwei klare Gruppen von Tumoren nach der Anzahl und Verteilung der chromosomalen SV unterscheiden, die nicht mit der Primärlokalisation des Melanoms oder der Abstammung des Patienten zusammenhängen. Insgesamt belegen unsere Ergebnisse, dass Schleimhautmelanome sehr heterogen sind, je nach zugrunde liegenden mutagenen Prozessen und lokalisationsspezifischen Treibermutationen, und dass auch die Abstammung des Patienten bzw. die geografische Lage relevante Faktoren sein könnten.

Die große Zahl der Proben aus unterschiedlichen Primärtumorlokalisationen ermöglichte uns die erste detaillierte Beschreibung der mutagenen Prozesse, die dem Schleimhautmelanom zugrunde liegen. Interessanterweise wurde im Widerspruch zu früheren Berichten festgestellt, dass einige Schleimhautmelanome aus dem Gesichtsbereich Mutationen aufwiesen, die auf UVR-Exposition zurückgehen, während in Schleimhautlokalisationen der unteren Körperhälfte solche Mutationen nachweislich nicht vorlagen. Dass ein Bindehautmelanom eine UVR-assoziierte Signatur enthielt, war angesichts der direkten Sonnenexposition dieser Lokalisation zu erwarten; jedoch belegen unsere Daten, dass auch ein Teil der Schleimhautmelanome in der Nasen- und den Nasennebenhöhlen sowie der Mundhöhle unter einem gewissen Einfluss von UVR-Exposition entstanden sind. Im Vergleich zu Hautmelanomen [7] ist die UVR-assoziierte Mutationslast von sinonasalen und oralen Schleimhautmelanomen allerdings gering. Dennoch sprechen die Anzeichen UVR-assoziierter Mutagenese in Schleimhautmelanomen der Gesichtsregion dafür, dass reflektierte oder abgeschwächte UVR-Exposition auch an diesen relativ sonnengeschützten Stellen eine Rolle als Karzinogen spielt. Dass UVR-Signaturen überwiegend in Proben von Patienten ostasiatischer Abstammung vorliegen, könnte daran liegen, dass in dieser Studie Tumoren aus der oberen Körperhälfte vor allem von chinesischen Patienten stammten, oder es könnte andere geografische Faktoren widerspiegeln. Ebenso deutet die Tatsache, dass Signatur 17 nur bei Patienten ostasiatischer Abstammung auftrat, darauf hin, dass geografiespezifische Umwelt- oder genetische Faktoren eine Rolle bei der Entstehung von Schleimhautmelanomen spielen könnten. Eine größere Proben-Kohorte aus jeder ethnischen Abstammungsgruppe wäre erforderlich, um diese Aspekte vollständig zu klären.

Jedoch lässt sich sagen, dass man den Großteil der Mutationslast beim Schleimhautmelanom keinen bekannten Karzinogenen zuordnen kann. Zu den dominanten, nicht-UVR-assoziierten mutagenen Prozessen zählten die altersassoziierten Mutationsprozesse von Signatur 1 (spontane Desaminierung von 5-Methylcytosin), ein endogener Prozess, der bei der großen Mehrheit aller Krebserkrankungen beteiligt ist [15]. Der Anteil der Signatur-1-assoziierten Mutationen war in Schleimhautmelanomen der unteren Körperhälfte signifikant höher als in denen der oberen Körperhälfte. Es ist erwiesen, dass der Prozess der spontanen Desaminierung von 5-Methylcytosin mit der mitotischen Zellteilung und dem Alter bei der Krebsdiagnose korreliert [15]. Während es im Alter bei der Diagnose zwischen den Patienten mit Schleimhautmelanomen der oberen und der unteren Körperhälfte keinen signifikanten Unterschied gab, waren die Patienten ostasiatischer Abstammung, von denen der Großteil der Tumoren der oberen Körperhälfte stammte, im Schnitt älter als die Patienten europäischer (sic!) Abstammung. Daher sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, um zu klären, ob der höhere Gehalt an Signatur 1 in den Tumoren aus der unteren Körperhälfte tatsächlich eine lokalisationsspezifische biologische Gegebenheit widerspiegelt oder aber eine Auswirkung der ethnischen Abstammung der Patienten darstellt, deren Tumorproben in unserer Studie untersucht wurden.

Unsere Multitool-Analyse der SMG identifizierte SPRED1 als Treiber beim Schleimhautmelanom; das Gen war in Tumoren unterschiedlicher Lokalisationen mutiert. SPRED1 ist ein Tumorsuppressor, der wirkt, indem er NF1 an die Plasmamembran transportiert, welches dort den RAS-GTP-Signalweg inhibiert. Ablain et al. [29] berichteten kürzlich über den Verlust von SPRED1 als Treiber von Schleimhautmelanomen. Der Funktionsverlust von SPRED1 resultiert in erhöhter Aktivität auf dem MAP-Kinase-Signalweg [30]. Doch während beim Hautmelanom NF1- und SPRED1-Mutationen meist gemeinsam auftreten [7, 31], wurden in unserer Studie zu Schleimhautmelanomen die meisten SPRED1-Aberrationen (11/13) in WGS-Proben mit NF1-Wildtyp gefunden; nur zwei SV in SPRED1 waren mit NF1-Mutationen vergesellschaftet.

Übereinstimmend mit früheren Berichten [7, 10, 31] fanden wir bei einem erheblichen Anteil der Schleimhautmelanome Aberrationen im MAP-Kinase-Signalweg vor, einschließlich häufiger Mutationen von NRAS, BRAF, NF1 und KIT. Darüber hinaus wurden Mutationen in mehreren weiteren bekannten Tumor-Treibergenen identifiziert, z. B. in CTNNB1, was auf eine bisher unbeachtete Beteiligung der WNT-Signaltransduktion an der Entstehung von Schleimhautmelanomen hinweist. Da für den Wnt/β-Catenin-Signalweg auch erwiesen ist, dass er zum T-Zell-Ausschluss führt [32], tragen CTNNB1-Mutationen möglicherweise auch zu dem vergleichsweise schlechten Ansprechen auf Immuntherapien bei, das bei einigen Patienten mit Schleimhautmelanomen in fortgeschrittenen Stadien beobachtet worden ist [33, 34]. Hotspot-Mutationen wurden außerdem in den Onkogenen MAP2K1 und KRAS gefunden, was in Verbindung mit einer BRAF-Fusion die zentrale Rolle der Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs bei dieser Tumorart unterstreicht.

Unsere Studie liefert wichtige Erkenntnisse zur Komplexität und Diversität der SV-Last beim Schleimhautmelanom. Viele der SV-Ereignisse betrafen wohlbekannte Melanom-Treibergene (CDKN2A, NF1, PTEN, TERT) und belegen somit deren Rolle auch in der Pathogenese von Schleimhautmelanomen. Wir stellten fest, dass man die Schleimhautmelanome in zwei distinkte Untergruppen unterteilen kann, je nach Grad der lokalisierten komplexen chromosomalen Rearrangements. Diese Cluster deckten sich jedoch nicht mit der Unterscheidung nach oberer vs. unterer Körperhälfte oder nach genetischer Abstammung, was dafür spricht, dass sie sich auf anderen gemeinsamen Wegen einige Zeit nach der Initiierung herausbilden. Regionen lokalisierter Komplexität könnten die Folge einer genomischen Katastrophe wie z. B. einer Chromothripsis sein. Wir identifizierten in einigen Tumoren Muster, die dem einer Chromothripsis oder eines BFB ähnelten. Darüber hinaus fanden wir in einer Reihe Tumoren Regionen amplifizierter Loci auf mehreren Chromosomen, die durch eine zahlreiche Translokationen untereinander verknüpft waren. Ähnliche Muster haben wir zuvor bereits beim Ovarialkarzinom entdeckt [13]; sie sind charakteristisch für Double-minute-Chromosomen [35, 36] oder Neochromosomen [37]. Mehrere Schleimhautmelanome in unserer Kohorte zeigten ein Muster von Translokationen unter Beteiligung von 12p-Amplifikationen, das dem Bild von Neochromosomen bei Liposarkomen ähnelt [37].

Lokalisierte strukturelle Rearrangement-Ereignisse betrafen eine Reihe von Regionen, darunter 5p, 11p und 12p, und eine gemeinsame Auswirkung dieser komplexen Ereignisse war die Amplifikation von Onkogenen wie z. B. TERT, MDM2, CCND1 oder CDK4. Diese Regionen wurden außerdem als signifikante rekurrente Bruchpunktregionen (SRB) mit Genamplifikationen identifiziert und sind eher auf positive Selektion zurückzuführen als auf Fragilität des Genoms [38]. Die Amplifikation von Onkogenen oder anderen tumorassoziierten Genen, die einen Wachstumsvorteil verleihen, ist somit ein potenziell wichtiger Mechanismus bei der Entstehung von Schleimhautmelanomen.

Acht Tumoren in dieser Studie wiesen Translokationen zwischen 5p und 12p auf, welche meist zu Amplifikationen von MDM2/CDK4 und TERT führten; bis auf einen stammten alle diese Tumoren aus der Mundschleimhaut und von Patienten ostasiatischer Abstammung. Bemerkenswert ist hierbei auch, dass die Mundschleimhautmelanome mit diesen Translokationen in signifikant niedrigerem Alter auftraten als solche ohne diese Translokationen. Dieser Befund deutet auf eine molekulare Diversität der prädominanten Treibergene zwischen Schleimhautmelanomen unterschiedlicher Lokalisationen hin. Hierfür spricht auch der Bericht von Lyu et al. [4] über Amplifikationen von 12q14 und 5p15 bei ∼50 % der Mundschleimhautmelanome, wobei 6/19 Tumoren Amplifikationen in beiden Regionen aufwiesen.

Eine mögliche Auswirkung genomischer Instabilität im Rahmen des Schleimhautmelanoms sind Veränderungen bei der Telomer-Erhaltung und -Länge. Ein Schlüsselereignis für die Immortalisierung von Zellen ist ein Mechanismus zur Telomer-Erhaltung, mit dem die Zelle sich der Einleitung des Zelltods entziehen kann, und ein möglicher Weg hierzu ist die Aktivierung der Telomerase (TERT) oder alternative Verlängerung der Telomere (ALT) infolge der Inaktivierung von ATRX. Wir identifizierten einander ausschließende ATRX-Funktionsverlustmutationen und mutmaßlich aktivierende TERT-Promoter-Mutationen und -Amplifikationen, was darauf hinweist, dass die beiden Erhaltungsmechanismen für distinkte Untergruppen von Schleimhautmelanomen von Bedeutung sind. Die in dieser Kohorte vorliegende Assoziation zwischen KIT und TL ist zuvor noch nicht beschrieben worden; weiterführende Forschungsarbeit ist erforderlich, um den ihr zugrunde liegenden Mechanismus zu identifizieren.

Die Erkennung von SPRED1 als Treiber erhöht den Anteil der Schleimhautmelanome mit bekanntem Treiber-Ereignis im MAP-Kinase-Signalweg (NF1, NRAS, BRAF, SF3B1, TP53, KIT, SPRED1) auf 92 % der untersuchten Patienten. Die MEK/MAPK-Inhibition könnte somit für einen großen Teil der Patienten mit Schleimhautmelanomen geeignet sein; dies gilt es in klinischen Studien zu prüfen. Treiberereignisse mit Beteiligung von CDK4 bei einem großen Teil unserer Fälle deuten darauf hin, dass CDK4-Inhibitoren bei dieser Tumorart eine therapeutische Option darstellen könnten. Tatsächlich haben Zhou et al. [39] kürzlich gezeigt, dass diese Inhibitoren bei von Patienten gewonnenen Schleimhautmelanom-Xenotransplantaten mit CDK4-Aberrationen Wirkung zeigten, und somit experimentelle Belege für dieses Konzept geliefert. Immuntherapien gehören bei Patienten mit metastasierenden Melanomen der Haut zum Standardrepertoire, doch Patienten mit Schleimhautmelanomen sprechen nur halb so oft auf PD-1-Antikörper an wie Patienten mit Hautmelanomen [8]. Wahrscheinlich ist die niedrige Mutationslast beim Schleimhautmelanom ein maßgeblicher Faktor für das begrenzte Ansprechen auf Immuntherapien. Unsere Daten lassen außerdem vermuten, dass die Aktivierung des β-Catenin-Signalwegs (über CTNNB1-Mutationen) ein weiterer Faktor ist [32]. Ein besseres Verständnis der Faktoren, die die Immunogenität beim Schleimhautmelanom regulieren, ist erforderlich, um bessere Behandlungsergebnisse bei den betroffenen Patienten zu erzielen; begleitend dazu werden umfassende molekulare Analysen der Punkt- und strukturellen Mutationen benötigt, um alle therapeutischen Möglichkeiten bei dieser schwierigen und heterogenen Tumorart aufzuzeigen.

Alle frisch gefrorenen und FFPE-Proben wurden den geltenden ethischen Vorschriften für die Arbeit mit menschlichen Probanden entsprechend gesammelt. Die frisch gefrorenen Gewebeproben und dazugehörigen Blutproben (n = 67), die in dieser Studie untersucht wurden, stammten aus folgenden Einrichtungen: Biospecimen Bank of the Melanoma Institute Australia (MIA) (n = 24), Peking University Cancer Hospital & Institute, Beijing, China (n = 39), Kirurgiavdelning, Skånes universitetssjukhus, Schweden (n = 3) und Biobank des URPP (University Research Priority Program) für translationale Krebsforschung am Universitätsspital Zürich, Schweiz (n = 1). Alle Gewebe- und Blutproben sind Teil der prospektiven Sammlung der frisch gefrorenen Proben mit begleitender Patienteninformation und Einwilligung. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Sydney Local Health District RPAH Zone genehmigt (Protokollnr. X15–0454 – zuvor X11–0289 und HREC/11/RPAH/444; Protokollnr. X17–0312 – zuvor X11–0023 und HREC/11/RPAH/32; Protokollnr. X15–0311 – zuvor X10–0300 und HREC/10/RPAH/530), und die einzelnen Fälle wurden von den institutionellen Ethikkommissionen des Peking University Cancer Hospital & Institute (Krebsklinikum Beijing), des Klinikums der Universität Skåne sowie des Universitätsspitals Zürich genehmigt. In den frisch operativ entnommenen Proben wurde nach Makrodissektion nach Tumorgewebe gesucht (mit so wenig kontaminierendem gesundem Gewebe wie möglich), dieses wurde in flüssigem Stickstoff innerhalb von 1 h nach der Operation tiefgefroren. Alle Proben wurden vor dem Einschluss in die Studie pathologisch untersucht; Voraussetzungen für den Einschluss waren mehr als 80 % Tumorzellgehalt und weniger als 30 % Nekrose. Alle Proben wurden von R.A.S., P.M.F. und T.J.D. als Experten für Melanompathologie unabhängig begutachtet, um das Vorliegen eines Melanoms und die Erfüllung der vorgenannten Kriterien zu bestätigen [40]. Alle Fälle wurden von den Studienpathologen R.A.S., P.M.F. und Z.L. zentral begutachtetet, um zu bestätigen, dass der jeweilige Tumor aus der Schleimhaut entsprungen ist und nicht aus der benachbarten Haut des Mund-, Nasen-, Anal- oder Genitalbereichs. Bei Bedarf wurde eine Tumoranreicherung der Proben mittels Makrodissektion oder Coring des gefrorenen Gewebes (Cryoxtract, Woburn, MA, USA) mit einem markierten H&E-Träger als Referenz vorgenommen. Schleimhautmelanome waren definiert als Melanome der Schleimhaut im Mund, in den Atemwegen, im Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt. Die H&E-Träger der primären Melanome wurden in allen Fällen begutachtet, und alle Tumoren, die ihren Ursprung in der Übergangszone von Haut und Schleimhaut hatten, wurden ausgeschlossen.

Ein Validierungsset von humanen Schleimhautmelanomen (n = 45) (definiert als Melanome der Schleimhaut im Mund, in den Atemwegen, im Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt) wurden als FFPE-Gewebe aus drei klinischen Zentren beschafft (University of Michigan, University of Edinburgh und University of California, San Francisco) wie von Wong et al. beschrieben [41]. Alle FFPE-Exom-Fälle wurden ethisch von den zuständigen lokalen Gremien der University of Michigan, University of Edinburgh und University of California, San Francisco sowie vom Human Materials and Data Management Committee des Sanger Institute genehmigt. Alle Proben wurden vor dem Einschluss in die Studie von spezialisierten Dermatopathologen untersucht. Von allen Proben wurden Gewebekerne entnommen, mit einem markierten H&E-Träger als Referenz.

Die Extraktion von Tumor-DNA aus frisch-gefrorenen Tumorgewebeproben erfolgte mit den DNeasy Blood and Tissue Kits (69506, Qiagen Ltd) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Extraktion von Blut-DNA erfolgte aus Vollblut mit Flexigene DNA Kits (51206, Qiagen Ltd). Alle Proben wurden mit NanoDrop (ND1000; Thermo Scientific) und Qubit® dsDNA HS Assay (Q32851; Life Technologies) quantifiziert, und die DNA-Länge und -Qualität wurde mittels Gelelektrophorese untersucht. Proben mit einer Konzentration unter 50 ng/µl oder ohne hochmolekulares Band im Elektrophoresegel wurden von den weiteren Analysen ausgeschlossen.

DNA aus Tumorproben, die als FFPE-Gewebekerne vorlagen, wurde mit QIAamp FFPE Tissue Kits (Qiagen) gemäß Anweisungen des Herstellers extrahiert und mit dem Qubit® dsDNA HS Assay (Q32851; Life Technologies) quantifiziert [41].

67 Patienten wurden der Paired-End-Sequenzierung des ganzen Genoms auf einem HiSeq2000 oder HiSeq X Ten System (Illumina, San Diego, CA, USA) am Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australia), bei Macrogen (Geumcheon-gu, Seoul, South Korea) oder bei der Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd, China unterzogen. Der Aufbau der Bibliothek erfolgte mit TruSeq DNA Sample Preparation Kits (Illumina) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alle nachgelagerten Verarbeitungsschritte einschließlich des Sequenz-Alignments und der Variantendetektion geschahen bei QIMR Berghofer (Brisbane, Australien) mit derselben Analyse-Pipeline für alle Whole-Genome-Proben. Auf das Adapter-Trimming der Sequenzdaten mit Cutadapt [42] (Version 1.9) folgte das Alignment auf die GRCh37-Assembly mit BWA-MEM (Version 0.7.12) und SAMtools (Version 1.1). Doppelte Auslesungen wurden mit Picard MarkDuplicates markiert (https://broadinstitute.github.io/picard (Version 1.129); http://picard.sourceforge.net). Die Beurteilung der Sequenzierungs- und Alignmentqualität der Probe erfolgte mit qProfiler (Version 1) und die Schätzung der Sequenziertiefe mit qCoverage (Version 0.7pre; http://sourceforge.net/projects/adamajava). Alle Tumoren hatten einen Tumorzellgehalt von mindestens 15 %. Die Höhe des Tumorzellgehalts wurde mittels ascatNGS bestimmt. Wenn das ascatNGS-Ergebnis unzuverlässig war (nach manueller Prüfung), wurde die mittlere variante Allelhäufigkeit verwendet (online Datensupplementary 1).

Die 45 aus FFPE-Präparaten gewonnenen Tumorproben, die die Validierungskohorte bildeten, wurden am Wellcome Trust Sanger Institute (Hinxton, Großbritannien) einem Whole-Exome-Sequencing unterzogen [41]. Die Sequenzierungs-Bibliotheken wurden mit Agilent SureSelect All Exon V5 Kits erzeugt und auf der HiSeq2500 Platform (Illumina, San Diego, CA, USA) zur Erzeugung von 75-bp-Reads sequenziert. Die Sequenzierungsdaten wurden mittels BWA-MEM (Version 0.7.12) mit der Humangenom-Assembly GRCh38 abgeglichen, und mit Biobambam (Version 2.0.18) wurden PCR-Duplikate markiert. Die BAM-Daten wurden mit SAMtools auf Probenniveau gebracht [43]. Um sicherzustellen, dass die Tumorproben und die parallelisierten normalen Kontrollproben so gut wie möglich übereinstimmten, wurde SAMtools mpileup und danach BCFtools gtcheck ausgeführt, um mögliche Vertauschungen und Kontamination der Proben zu erkennen. Zur Beurteilung der Sequenzierungs- und Alignmentqualität wurde mit SAMtools stats die Sequenziertiefe und PCR-Duplikatrate in Bait-Regionen plus 100 bp Flanken auf beiden Seiten untersucht. Qualitätsgefilterte BAM-Dateien wurden für die nachgelagerte Analyse erzeugt, indem PCR-Duplikate ebenso entfernt wurden wie Daten, die nicht die Anforderungen für Illumina-Chastity-Filterung und zusätzliche und sekundäre Read-Alignments erfüllten. Weiterhin wurden Daten entfernt, wenn zwei Reads dieselbe Startposition hatten und einer eine Mappingqualität von Null hatte und auf eine beliebige repetitive Stelle verwies – ein häufiges Artefakt in Bibliotheken aus FFPE-Proben. Die Untersuchung auf Vertauschungen und Kontamination der Proben mittels BCFtools und Coverage-Metrik wurde wieder an den qualitätsgefilterten BAM-Dateien durchgeführt.

Der Nachweis von somatischen SNV und indels erfolgte mit einer etablierten Pipeline [7], bei der eine duale Detektionsstrategie für die SNV zum Einsatz kam und der Konsens aus zwei verschiedenen Tools in der weiteren Analyse verwendet wurde: qSNP (Version 2.0) [44] und GATK HaplotypeCaller (version 3.3–0) [45]. Der Nachweis von indels (1–50 bp) erfolgte mittels GATK. Die Annotation der Varianten zu den Gen-Konsequenzen erfolgte in SnpEff.

Die Detektion somatischer SNV erfolgte mit MuTect (v1.1.7) [46]. MuTect wurde mit einigen nicht-standardmäßigen Parametern ausgeführt, um die Kontamination normaler Kontrollproben mit Tumor-DNA sowie bei FFPE-Proben aufgetretene Qualitätsprobleme zu überwinden. Unter anderem galten folgende Parameter: Die normalen Kontrollproben durften <5 % Reads mit einem alternativen Allel und <4 Reads absolut mit dem alternativen Allel haben; etwas Clustering der alternativen Allele bei gleichbleibender Entfernung zum Anfang/Ende des Reads war zulässig, dazu wurde die Anforderung für den Ausschluss auf Basis des Read-Anteils mit Clipping von 0,3 auf 0,25 herabgesetzt; und der Basen-Qualitätsscore, der mindestens erreicht werden musste, damit eine Base einbezogen wurde, wurde heraufgesetzt. Der Grenzwert für den Basen-Qualitätsscore wurde deshalb geändert, weil ein Artefakt (entweder aus der PCR oder aus der Sequenzierung) identifiziert wurde, bei dem nach Polynukleotid-Läufen durchgängig sowohl Referenzbasen in schlechter Qualität als auch Basen-Mismatches vorlagen. Dann folgte die Filterung der MuTect-Varianten mittels mehrstufiger BCFtools-Filter, basierend auf Sequenziertiefe und Varianten-Allelfraktion (VAF). SNV wurden ausgeschlossen, wenn eins der folgenden Kriterien erfüllt war: Sequenziertiefe unter 10; VAF < 0,20 mit Tiefe < 20; VAF < 0,05; VAF > 0,15 und Anzahl unterstützender Reads <5; VAF < 0,30 und normale Kontrolle enthielt 3 oder mehr alt-Reads; oder normale Kontrolle enthielt 2 (oder mehr) alt-Reads und Tumor-VAF <0,20. Weitere Filter wurden auf die MuTect-Varianten angewendet, u. a. zur Entfernung häufiger Varianten (>0,01) in gnomAD [47] und Prüfung auf alternative Allele in unzusammenhängenden normalen Proben in SAMtools mpileup. Varianten, für die es drei oder mehr alternative Allele in mindestens zwei unzusammenhängenden normalen Proben gab, wurden als falsch-somatisch identifiziert und ausgeschlossen.

Da MuTect keine Multinukleotidvarianten (MNV) erkennt, wurde die Software MAC v1.2 (Multi-nucleotide Variation Annotation Corrector; https://github.com/hubentu/MAC) auf die durch MuTect identifizierten Varianten angewendet. MAC erstellt eine Liste der SNV und führt eine Prüfung unmittelbar und mittelbar benachbarter SNV sowie ein Phasing durch. Mit intern erstellten Scripten wurde der Output von MAC genommen, um wiederholte Varianten-Effekt-Prognosen zu MNV zu erstellen und VCF-Einträge zu korrigieren. Somatische indels wurden mit Strelka (v1.0.15) detektiert [48]. Mittels Filterung wurden in gnomAD häufige indel-Varianten (>0,01) entfernt. Mit Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) [49] und Genmodellen von Ensembl Release v89 wurden Prognosen für Mutationsauswirkungen von SNV und indels erstellt.

Zur Ermittlung der genetischen Abstammung des Patienten wurden die Genotypen der Schleimhautproben mit den Genotypen von Populationen verglichen, die im Rahmen des 1000-Genome- (1000G-)Projekts untersucht wurden [50]. Genotypen aus Phase 3 des 1000-Genome-Projekts wurden im plink-Format von der Plink-2.0-Website heruntergeladen (https://www.cog-genomics.org/plink/2.0/resources#1kg_phase3). Von den 67 WGS-Schleimhautproben wurden Pileups an den 1000G-SNP-Positionen durchgeführt und eine VCF-Datei erstellt. Anhand der folgenden Kriterien wurde ein Genotyp zugeordnet: (i) homozygot für den Referenz-Genotyp (0/0) wenn die Varianten-Allelfraktion (VAF) ≤0,2 ausmachte; (ii) heterozygot (0/1) bei VAF über >0,2 und <0,8; (iii) homozygot für das alt-Allel (1/1) bei VAF ≥0,8. Positionen mit einer Sequenziertiefe unter 10 bei jeglichen Proben führten zum Ausschluss. Die VCF- wurde in eine plink-Datei konvertiert und eine Abstammungsprüfung wurde gemäß der im plinkQC-R-Paket „Ancestry check“ beschriebenen Methode durchgeführt. Alle weiteren Analysen wurden mit Plink Version 1.90b6.8 durchgeführt. Die Genotypen der Schleimhautproben wurden um Varianten mit Kopplungsungleichgewicht (LD; linkage disequilibrium) mit einem r2 über 0,2 in einem 50-kb-Fenster bereinigt, und auch Bereiche mit bekanntem hohem LD-Aufkommen wurden entfernt. Die Genotypen von 2.504 Referenz- (1000G-)Proben und 67 Schleimhautproben wurden nach Bereinigung um Chromosomen- oder Positionen-Mismatches und nach Aktualisierung von Allel-Flipping zusammengeführt. Varianten mit einer Fehlrate über 0,1 oder einer Minor-Allel-Häufigkeit unter 0,05 wurden entfernt. Eine Hauptkomponentenanalyse wurde mit 39.156 Varianten durchgeführt, und von den Hauptkomponenten 1 und 2 wurden Plots mit der Plottingfunktion in plinkQC erstellt (online Supplement, Abb. 1). Proben, weder Cluster mit der europäischen noch mit der ostasiatischen (d. h. chinesischen) Abstammung ergaben, erhielten den Status „Sonstige“.

Mit dem von Alexandrov et al. [12] beschriebenen Verfahren der nicht-negativen Matrixfaktorisierung (NMF) wurden Mutationssignaturen in den WGS-Proben detektiert. Um den Anteil jeder Signatur in einer Probe zu bestimmen, nutzten wir das im R-Paket enthaltene Tool für die quadratische Optimierung [51], um die Mutationen in jeder Probe den durch NMF identifizierten Signaturen zuzuordnen. Um übermäßiges Fitting zu vermeiden, wurden Signaturen mit einem Anteil von weniger als 10 % an einer Probe ausgeschlossen, und die Mutationen wurden den verbleibenden Signaturen zugeordnet. Die resultierenden Signaturen wurden mit den Signaturprofilen (SBS1–SBS60) abgeglichen, die in der kürzlich erfolgten Analyse von über 4.000 vollständigen Tumorzellgenomen im Rahmen des PCAWG-Projekts (Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes) aufgestellt wurden [15]. Das Vorliegen eines Strang-Bias der Signatur bei der Transkription wurde mit dem R-Paket MutationalPatterns geprüft [52]. Wegen geringer Mutationslast wurde die FFPE-Validierungskohorte nicht auf Mutationssignaturen untersucht.

Wir verwendeten ein Konsensverfahren mit mehreren Tools für die Entdeckung von SMG mit SNV/indels. Die verwendeten Tools waren die Oncodrive-Suite [53, 54], MuSiC2 (ref. 55), 20/20 + 56, dNdScv [57] und MutSigCV. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Tools mit den Standardeinstellungen verwendet. Die Oncodrive-Suite umfasste drei Methoden: OncodriveFM, OncodriveClust und OncoDriveFML. OncodriveFML wurde mit CADD v1.0 über die Webschnittstelle unter folgender Adresse ausgeführt: http://bbglab.irbbarcelona.org/oncodrivefml/home. OncodriveFM und OncodriveCLUST wurden über folgende Webschnittstelle ausgeführt: https://www.intogen.org/. Um im Sinne der Tools als signifikant zu gelten, wurde in OncodriveFM und OncodriveCLUST ein q-Wert von 0,05 angesetzt und in OncodriveFML ein Wert von 0,1. MuSic2 (v0.2) wurde mit einer ROI-Datei (region of interest) für hg19 ausgeführt (abgerufen von https://github.com/ding-lab/calc-roi-covg). Ein Gen galt als signifikant, wenn die FDR im kombinierten Fisher-p-Wert-Test <0,05 war. In MutSigCV und dNdScv galt ein Gen bei einem q-Wert von <0,1 als signifikant. Mit dem Tool 20/20+ wurden 10.000 Iterationen mit dem vorab trainierten Classifier „2020plus_10k.Rdata“ ausgeführt. Durch Prüfung der p-Wert-QQ-Plots wurde bestätigt, dass die Prognosen nicht duch falsch-Positive verfälscht waren (mittlere absolute log2-Veränderung [MLFC] unter 0,3). Ein Gen galt als signifikant, wenn der q-Wert eines Onkogens, Tumorsuppressorgens oder Treibergens unter 0,05 lag. In eine Konsensliste von 10 signifikanten Genen wurden diejenigen Gene aufgenommen, die laut mindestens zwei verschiedenen Tools signifikant waren (die verschiedenen Oncosuite-Methoden galten hierbei als ein einziges Tool). Protein-Lollipop-Mutationsdiagramme wurden mit dem Tool lollipops erstellt [58].

Strukturvarianten (SV) wurden mit qSV35 ermittelt. Bruchpunkte und mögliche Konsequenzen der SV (einschließlich potenzieller In-Frame-Genfusionen) wurden durch Annotation gemäß in Ensembl bekannter Gene (Version 75) mit intern erstellten Scripts ermittelt. Das Vorliegen von Fusionsereignissen in Genen des COSMIC Cancer Gene Census sowie in Kinase-Genen wurde untersucht. Die Liste der COSMIC-Gene wurde am 20. Dezember 2017 heruntergeladen (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Alle Gene von Ebene 1 und 2 wurden berücksichtigt. Die Proteinkinasen wurden am 20. Dezember 2017 von Uniprot heruntergeladen (http://www.uniprot.org/docs/pkinfam.txt). Als Gene, die rekurrent von Rearrangement-Bruchpunkten betroffen sind, wurden COSMIC-Tumorgene mit Rearrangements bei mindestens vier Patienten eingeschlossen. Gene, die in der SMG-Analyse in dieser Studie identifiziert wurden oder die zuvor als Treibergene für Melanome identifiziert wurden, wurden ebenfalls in die SV-Analyse eingeschlossen.

Die Kopienzahlen wurden mit den Sequenzierungsdaten und dem Tool ascatNGS ermittelt [59]. In der Analyse wurden ein Verlust bei der Kopienzahl (Kopienzahl 1), die homozygote Deletion (Kopienzahl 0) und die Amplifikation (Kopienzahl ≥6) betrachtet. Die Kopienzahl pro Gen wurde durch Annotation gemäß in Ensembl bekannter Gene (Version 75) ermittelt. Regionen mit signifikant mutierten Kopienzahlen wurden mit GISTIC2.0 untersucht. Ein Gen galt als signifikant, wenn es mit einem Konfidenzniveau von 0,95 und einem q-Wert <0,1 in der Fokusregion lag. Eine kurze Liste von Genen wurde durch manuelle Kuratierung und Filterung für COSMIC-Gene erstellt.

Wir verwendeten zur Identifizierung von Rearrangement-Signaturen dasselbe statistische Gerüst mit NMF, das auch für die Mutationssignaturanalyse verwendet wurde [12]. SV wurden in dieselben Kategorien eingestuft wie von Nik-Zainal et al. für eine Brustkrebs-Kohorte beschrieben und durchgeführt [17]. SV wurden in folgende Ereignisarten eingestuft: Deletionen, Duplikationen, Inversionen und interchromosomale Translokationen. Weiterhin wurden die SV nach ihrem Umfang charakterisiert und danach, ob die Bruchpunkte in Clustern vorlagen oder nicht. Die Größenkategorien (für Nicht-Translokations-Ereignisse) waren 1–10 kb, 10–100 kb, 100 kb–1 Mb, 1–10 Mb und mehr als 10 Mb. Das Clustering der SV-Bruchpunkte wurde mit der BEDTools-Clusterfunktion festgestellt. Als Cluster von Ereignissen galt es, wenn ≥10 Bruchpunkte in einem Fenster von 1 Mb vorlagen – ein Kriterium, das so bereits von Letouze et al. angewendet worden ist [60]. Vorliegen von Bruchpunkt-Clustern auf Einzelchromosombasis [13]: Chromosomen mit hochgradig signifikanter nicht-zufälliger Verteilung von Bruchpunkten mit einem stringenten Schwellenwert von p < 10–⁵ galten als Cluster. Chromosomen mit einer hohen Zahl von Rearrangement-Ereignissen wurden als Ausreißer identifiziert, definiert als Bruchpunkte-pro-Megabase-Rate über dem 1,5-Fachen der Länge des Interquartilsabstands vom 75. Perzentil jeder Probe mit einem Mindestwert von 35 Bruchpunkten pro Chromosom. Chromosomen mit 10 oder mehr Translokationen galten als Chromosomen mit einer hohen Zahl von Translokationen.

Unüberwachtes hierarchisches Clustering der Rearrangement-Signaturen wurde mit dem R-Paket «ConsensusClusterPlus» durchgeführt [61]. Die für das Clustering verwendeten Daten waren die Anteile der Rearrangements, die den fünf Signaturen zugeordnet waren. Die Anteile jeder Signatur wurden vor dem Clustering mittelwertzentriert, und die folgenden Einstellungen wurden verwendet: pItem = 0,9, pFeature = 0,9, Pearson-Distanzmetrik, Anzahl Wiederholungen = 1000.

Lokal begrenzte Regionen von Hypermutation, sogenannte Kataegis-Genloci, wurden mittels zuvor etablierter Metriken identifiziert [13]: Die Intermutationsdistanz wurde als Anzahl Basenpaare zwischen den Mutationen berechnet, geordnet nach Chromosom und Position. Diese Abstände wurden mittels stückweisem konstantem Fitting segmentiert, und mutmaßliche Kataegis-Regionen waren definiert als Segmente mit sechs oder mehr aufeinanderfolgenden Mutationen mit einer mittleren Intermutationsdistanz von ≤1000 bp.

Die Feststellung der TL erfolgte mit Sequenzierungsdaten und dem Tool qMotif7. qMotif ist frei verfügbar unter http://sourceforge.net/projects/adamajava und zählt aus, wie viele Reads den Telomer-Repeat (TTAAGG) enthalten. Die Zählwerte werden auf die mittlere genomische Abdeckung der jeweiligen Probe normalisiert, und die relative TL wird als log2-Ratio der Read-Werte in der Tumor-BAM-Datei zu den Read-Werten der BAM-Datei der parallelisierten gesunden Kontrolle ausgedrückt.

Die Website «Cancer Genome Interpreter» (www.cangergenomeinterpreter.org) [62] wurde genutzt, um klinisch handlungsrelevante Mutationen zu identifizieren. Folgende Arten von Mutationen wurden annotiert: codierende SNV/indel-Mutationen, Kopienzahlveränderungen in Form von Amplifikationen (Kopienzahl ≥6) oder homozygote Deletionen (Kopienzahl 0) sowie prognostizierte Inter-Gen-Fusionen. Der Output des Cancer Genome Interpreter (drug_precriptions.tsv) wurde wie folgt gefiltert: Alterations  =  complete, Tested tumor  =  Contains CANCER or CM. Evidenz nur auf präklinischer Ebene führte zum Ausschluss. Verweise auf BRAF-Inhibitor-Resistenz wurden bei Proben entfernt, die keine BRAF-Mutation enthielten.

Die statistischen Analysen wurden in R durchgeführt, und p-Werte <0,05 galten als statistisch signifikant. Zweiseitige Fisher-Exact-Tests wurden durchgeführt, wo angegeben. Wenn nicht anders angegeben, wurden zweiseitige Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt. Die Probenumfänge sind jeweils in den Abbildungen oder Bilderunterschriften angegeben. Boxplots zeigen jeweils den Median und das 25. und 75. Perzentil.

Diese Arbeit wurde von folgenden Stellen unterstützt: Melanoma Institute Australia (MIA), Bioplatforms Australia, New South Wales Ministry of Health, Cancer Council New South Wales, Program Grants of the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), Cancer Institute New South Wales sowie Australian Cancer Research Foundation. N.W., J.S.W., N.K.H. und R.A.S. werden durch NHMRC Fellowships unterstützt. K.N. wird durch ein Keith Boden Fellowship unterstützt. Die Sammlung der australischen Proben wurde durch die MIA unterstützt. Die Autorinnen und Autoren danken den Kolleginnen und Kollegen an folgenden Institutionen für ihre Unterstützung: MIA, Royal Prince Alfred Hospital, NSW Health Pathology, Westmead Institute for Medical Research. T.J.D. wurde durch das Jani Haenke Melanoma Pathology Fellowship unterstützt. P.M.F. wurde durch das Deborah and John McMurtrie MIA Pathology Fellowship unterstützt. G.V.L. wurde durch einen NHMRC Practitioner Fellowships Grant sowie einen University of Sydney, Sydney Medical School Foundation Grant unterstützt. B.C.B. wird durch NIH/NCI Grant Nr. 1R35CA220481 unterstützt.